SN_T 3198-2012猪盖塔病RT-PCR检测技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3198—2012猪盖塔病RT-PCR检测技术规范Quarantine protocol of RT-PCR for swine getah disease2013-05-01实施2012-10-23 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局D变1 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准猪盖塔病 RT-PCR 检测技术规范SN/T 3198-2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www. spc. net. cn中国标准出版社皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 0.5字数 10 千字2013年7月第一版2013年7月第一次印刷印数 11 600*书号：155066·2-25379 SN/T 3198—2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出人境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：王凯民、赵晓燕、姜焱、侯玉峰、李正高、郁兵、刘骏、唐泰山、陈国强、周斌、张常印。I SN/T 3198—2012猪盖塔病 RT-PCR 检测技术规范1 范围本标准规定了猪盖塔病的检疫规范。本标准适用于猪盖塔病的流行病学调查和口岸检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用子本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Getah:盖塔病4试剂与材料4.1 试剂见附录A.1，1.0%琼脂糖凝胶板制备见附录A.2。4.1.1电泳缓冲液TAE配制方法CAP基因片段作为阳性对照，以DEPC处理的灭菌蒸馏水作为阴性4.1.2，人工合成的猪盖塔病病毒对照。4.1.3 引物:引物 1(20 pmol/μL)CAP-1 5--cgcetcgaghtgaattadattccaagfcaa-3引物 2(20 pmol/μL)CAP-2:5-ctcctgcagccattct1ctgttccftctgg-3*4.1.4RT-PCR 反应试剂:PCR友应缓冲液、AMV,反转录酶、RNasé inhibitor 酶和 Taq 酶、dNTPs、MgCl2、DEPC处理灭菌蒸馏水。4.1.5电泳加样缓冲液:6×loading buffcr.4.1.6DNA相对分子质量标记:100 bp～2000 bp。4.2材料4.2.1PCR热循环仪。4.2.2电泳仪。4.2.3凝胶成像系统。5操作方法5.1样品处理5.1.1蚊虫样品处理取待检的蚊虫整体与用DEPC处理水配置的PBS研磨液按1：10比例混合置于研磨器中，在冰浴1 SN/T 3198--2012中研磨，取上清液，备用。5.1.2猪及其产品的处理用带有抗凝剂的采血管采集待检猪的血液混匀；或将组织样品与用DEPC处理水配置的PBS研磨液按1：10比例混合，在冰浴中研磨取上清液，备用。5.2样品RNA的制备5.2.1取200μl预处理的样品，加人800μLRNA提取液 TRIZOI，振荡混匀，室温放置5 min。5.2.2加人 200 uL三氯甲烷，剧烈振摇15 s，室温放置 2 min～3 min 后，12 000 r/min 离心15 min(4℃)。5.2.3吸上层水相于另一新离心管中，加人0.5 ml异丙醇，充分混匀，一20℃放置 15 min～30 min后,12 000 r/min离心10 min(4 ℃)。5.2.4弃去上清液，加75%乙醇1ml,振摇混匀，充分洗涤沉淀，7500 r/min离心5min（4℃）；弃去上清液，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μIDEPC处理水中，一70℃保存备用。5.3RT-PCR 反应体系配制采用 50 μL 的反应体系:10 XOne-step RNA PCR buffer 5 μL、MgCl（25 mmol/L)10 μl.、dNTPMixture(各 10 mmol/L)5 μl、RNase Inhibitor(40 U/μl.)1 μl、AMV Reverse Transcriptase XL(5 U/μL)1 μI、AMV-Optimized Taq(5 U/μL)1 μl、上游引物 CAP-1(20 pmol/μI.)1 μl、下游引物CAP-2(20 pmol/μL)1μL、模板10μl,加无RNA酶的水至总体积50 μl.，同时设阴阳性对照。5.4RT-PCR 反应的循环程序将PCR