SN_T 4273-2015国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4273--2015国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法Real time PCR detection methods of Banna virus at ports2016-01-01实施2015-05-26 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局、刮涂层查真伪。 SN/T 4273-2015前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：洪烨、丁国允、孙薇、周艳容、师永霞、郑夔、黄吉城、刘扬、戴俊、苏水宽、贺骥孙肖红、幸芦琴、李小波、钟玉清、相大鹏、郭波旋I SN/T 4273—2015国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸版纳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理，检验程序、方法及结果判定。本标准适用于国境口岸版纳病毒的实验室检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.11版纳病毒‧Banna virus版纳病毒（Banna virus,BAV)为 12 节段双链 RNA病毒，是种虫媒病毒，主要经蚊虫传播，可引起人类发热和病毒性脑炎，自前该病毒主要分布在我国和印度尼西亚等地区。版纳病毒电镜下观察为二十面体球形颗粒,表面有纤突,直径在 60 nm～70 nm之间。病毒的基因组由 12 个节段的双链（dsRNA)组成，全长约为21000 bp。3.2实时荧光 PCR real-time fluorescence PCR实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加人-套可反映PCR扩增过程的荧光报告系统，通过监测系统接收到荧光信号，实时判断每个反应管内目的基因的模板扩增情况。4主要仪器设备本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、II级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力20000×g）、玻璃研磨器、漩涡振荡器、冰箱（4℃、一20℃、一70℃或液氮罐）、移液器等。1 SN/T 4273--20155主要试剂本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAampViralRNAKitl’、实时荧光RT-PCR 通用试剂如 Ambion 公司的 Ag-Path-IDTM（Onc step RT-PCR Kit!’、PBS 溶液（pH 7.O）、无RNA酶的DEPC水、引物和探针（针对版纳病毒Vp12基因片段编码区核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1等。表 1版纳病毒实时荧光 RT-PCR 检测的引物和探针引物/探针名称序列(5-3)扩增片段大小Banna-FPCGTAATTTTATGGACCACCTGGABanna-RPCATAAGAAGCATGGCGACCTAG82 bpBanna-probeFAM-CTACTGGTCCTGTGCCGTTAGGTCCC-BHQ16标本的采集与处理6.1人体标本无菌采集发热期可疑病人的静脉血或脑脊液等标本 3mL～5 mI，血标本于室温静置30 min使其凝固，500×g离心10min，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中，脑脊液则直接装人2ml.无菌螺口塑料管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清或脑脊液置于一70℃保存。6.2蚊标本将采集的蚊子直接放人一20℃冰箱30 min以上冻死后，取出，分类编号，一般按30～50只一份，不足30只的可按采样点或分类归为份，装人2 mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号。于-70℃以下运输或保存。蚊标本处理时应在冰上操作。从一70℃容器中取出蚊标本，倒人研磨器中，加入PBS液1mI，反复研磨至组织碎片基本消失，随即将研磨液吸人1.5mL离心管，配平后置预冷4℃ 的离心机上，12000 r/min离心10 min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃以下容器以备复查。7 病毒核酸提取方法按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光RT-PCR检测。或-70℃储存RNA待检。8实时荧光 RT-PCR 检测8.1反应体系配制配制20 μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无 RNA酶的灭菌双蒸水 2.2uI、2×RT1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可