NY_T 2467-2013高粱品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.20B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2467--2013高梁品种鉴定技术规程SSR分子标记法Protocol for identification of sorghum varieties--SSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部3发布 4 NY/T 2467-—2013目次前言范围12规范性引用文件3术语和定义4原理.5仪器设备及试剂6溶液配制2引物信息8参照品种信息9操作程序10等位变异数据记录与统计11判定方法...附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂..附录B(规范性附录）溶液配制·-:附录C(规范性附录）核心引物·附录D(资料性附录）核心引物相关信息f NY/T 2467--2013前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口。本标准起草单位：吉林省农业科学院、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：李晓辉、王凤华、张春宵、张学军、周海涛、郝彩环、李淑芳、刘艳芝、陶蕊、李万军、徐宁。I NY/T梁品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列(simple sequcnce repeats，SSR)标记法进行高粱LSorghumbicolor(L.）Moench]品种鉴定的操作程序、等位变异数据记录与统计、判定方法。本标准适用于高粱品种的SSR指纹数据采集和品种鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB4404.1粮食作物种子禾谷类GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1品种variety已知最低一级植物分类单位中的个类群，不论是否充分满足植物新品种权的授权条件，该类群应该是：通过某一特定的基因或基因型组合所表达的特征来界定：一通过至少一种上述特征的表达，与任何其他植物类群有所区别；经过繁殖后其适应性未变的-个单位。[GB/T19557.1-2004,定义3.1]3. 2核心引物coreprimer品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。3.3参照品种referencevariety具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。用辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。4原理由于不同高粱品种遗传组成不同，基因组DNA存在简单重复序列的重复次数差异。这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同高梁品种。5仪器设备及试剂见附录A。1 NY/T 2467--20136溶液配制见附录B。7引物信息核心引物名单及序列见附录C，核心引物等位变异等相关信息参见附录D。8参照品种信息参见附录D。9操作程序9.1样品准备样品材料可为种、幼嫩叶片等组织或器官。试验样品为种子时，其质量应符合GB4401.1中对高粱种子纯度的要求。种子样品的分样和保存，应符合（GB/T3543.2的规定。应分析20个以上个体的混合样品，或至少5个个体（种子、叶片或其他等效物）的单个样品。9.2DNA提取9.2.1称取适量样品，液氮下迅速磨成粉末。9.2.2将粉末转人2.0ml.Eppcndorf管中，加人700μL65℃预热的CTAB缓冲液，并使其混匀。9.2.365℃水浴加热45min，不断地轻轻倒转摇动。水浴后，取出离心管，冷却垒室温。9.2.4通风橱下加人700μl的氯仿异戊醇（24：1)，轻轻倒转摇动5min～10min。9.2.512000g（室温）离心10min，用去头枪尖将上清液转至1个新的2.0mLEppendorf管中。9.2.6加人10μl.RNA酶溶液(10mg/mL),37℃下温浴30min。9.2.7重复9.2.4～9.2.5步骤。9.2.8加人--20预冷的异内醇（1倍体积）或无水乙醇（2倍体积）于2.0ml.Eppendorf管中，轻轻混匀。：20℃冰箱静置段时间后，至INA凝集，密温下钩出INA。9.2.976%乙醇洗涤2次（其中-次可过夜）。洗涤完毕后，将INA晾干。9.2.10加人适量的1×TE(p1I8.0)溶解于试管中，4℃下保存备用。9.2.11将DNA原液0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量(DL2000为Marker）。--20℃下保存备用。注