SN_T 4603-2016出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌常见致病基因检测方法 多重PCR及多重实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4603—2016出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌常见致病基因检测方法多重PCR及多重实时荧光PCR法Detection of toxigenic gene of Vibrio parahaemolyticus infood and water for export-Mutiplex PCR method andmutiplex real-time PCR method2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局香囍 SN/T#言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。将《美国FDA细菌学分析手册》第九章弧菌2004（Chapter 9：Vibrio 2004 of FDA BacteriologicalAnalytical Manual)以及SN/T2424一2010《进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光PCR方法》引物序列组合在一起，构成多重 PCR的体系。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海交通大学、上海市临床检验中心、昆明市西山区疾病预防控制中心。本标准主要起草人：陈丽萍、刘忠民、张继伦、陈芸、张建华、史贤明、王大鹏、王庆忠、王珏。一 SN/T 4603--2016出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌常见致病基因检测方法 多重PCR 及多重实时荧光 PCR 法1范围本标准规定了产毒副溶血性弧菌多重PCR 及多重实时荧光PCR检测方法。本标准适用于海产品、海产调味品、水体中产毒副溶血性弧菌常见致病菌基因的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测《美国 FDA细菌学分析手册》第九章　弧菌 2004（Chapter 9：Vibrio 2004 of FDA BacteriologicalAnalytical Manual)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1多重 PCR mutiplex PCR在同一个反应体系中加人一对以上的引物，同时检测几个目标基因的PCR方法。3.2多重实时荧光 PCR mutiplex real-time PCR在同一个反应体系中加人-对以上的引物,同时检测几个目标基因的实时荧光 PCR方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。tdh:耐热溶血毒素对应的基因（thermostable direct hemolysin)tlh：不耐热溶血毒素对应的基因（thermolabile hemolysin)trh：耐热直接溶血毒素相关溶血毒素对应的基因（thermostable related hemolysin)1 SN/T 4603—2016第一法多重 PCR 检测方法5方法提要在同一个 PCR反应管中,同时检测副溶血性弧菌 gyrase、tdh 和 trh 致病基因，根据扩增条带（gy-rase 91 bp;tdh 269 bp;trh 485 bp)的有无,判定样品中是否含有副溶血性弧菌及产毒副溶血性弧菌。6试剂和耗材除另有规定外，试剂为分析纯或化学试剂。实验室用水应符合GB/T6682规定的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1PCR反应预混液，可选用商业试剂盒。6.2细菌基因组 DNA 提纯试剂盒。6.3琼脂糖：电泳纯。6.4溴化乙锭(EB):10 g/L。6.5 0.5× TBE 缓冲液:Tris 5.4 g,硼酸 27.5 g,0.5 mol/L EDTA(pH 值=8.0)2 mL,加蒸馏水至1 000 mL。6.6无DNA酶污染的灭菌石蜡油:4℃保存。6.7引物：引物序列及相关信息见表1。表1引物序列和产物长度靶基因引物序列产物大小5-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-391 bpgyrase5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-35-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3tdh269 bp5-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-35-TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT-3trh485 bp5-CATAACAAACATATGCCCATTTCCG-37仪器和设备7.1PCR 仪。7.2恒温培养箱。7.3离心机：离心转速≥12 000 r/min。7