SN_T 2978-2011动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2978—2011动物源性产品中鸡源性成分PCR 检测方法PCR method for the detection of chicken componentsin animal derived products2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0数码防体 SN/T 2978—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院。本标准主要起草人：宗卉、曹琛福、张彩虹、杨俊兴、吕建强、阮周曦、曾少灵、陶虹、孙洁、刘建利、廖丽珊、卢体康、花群义、秦智锋。1 SN/T 2978-2011动物源性产品中鸡源性成分PCR 检测方法1范围本标准规定了动物源性产品中鸡源性成分检测的PCR方法。本标准适用于动物源性产品中鸡源性成分的定性检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.1　食品安全国家标准　食品微生物学检验总则GB/T5009.1食品卫生检验方法，理化部分总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样SN/T 1193基因检验实验室技术要求3试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。3.1鸡源性成分检测用引物（对)序列：上游：5-ctataatcgataatccacgattca-3,下游:5-cttgacctgtcttattagggagg-33.2裂解液(参见附录 A)。3.3电泳缓冲液(参见附录 A)3.4溴化乙锭(10 mg/mL)(参见附录 A)3.5阳性对照样品：采用已知含有鸡源性戒分的样品。3.6阴性对照样品：采用已知不含鸡源性成分的样品。3.7空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。4仪器设备4.1离心机（最大转速14000r/min）。4. 2 微量移液器(100 μL～1 000 μl,20 μL～200 μL,2 μL~20 μL,0. 5 μL～10 μL)。4.3 电泳仪。4.4凝胶成像仪。4.5恒温水浴锅(0℃～100℃）。 SN/T 2978—20115试样选取与制备根据不同的样品，饲料样品按照GB/T14699.1采样，或若粒度为20目称取200mg，60目称取100mg，100目称取50mg。食品样品按照GB/T5009.1和GB4789.1采样。将实验室样品研磨待用。6检验步骤6.1样品 DNA提取称取上述混匀样品50mg于1.5ml离心管中，加人600μl.～800μl.裂解液，65℃30min，期间不时振荡混匀；12000r/min离心5min;转移上清液于洁净离心管中，加400μL三氯甲烷/异戊醇（24：1），混匀；12000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；12000r/min离心5min，弃上清液；75%乙醇洗涤一次，晾干；加人50μL双蒸水（ddH,0)溶解沉淀，制成DNA溶液，待用。也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA6.2 PCR 扩增反应体系：体积为25μL,包括2×PCR缓冲液12.5μL、dNTPs(2 mmol/1.)5μL、引物对(10 nmol/L)各0. 5 μL、DNA 聚合酶(1 U/μL)1 μL、模板 DNA(100 ng±50 ng DNA)5 μL、双蒸水 0.5 μl。反应条件:PCR反应条件随不同的 PCR仪略有改变。94℃预变性1min～3min;94℃变性30 s～60 s,63℃退火30 s～60 s,72℃延伸30 s～60 s,35个循环;72℃延伸5min;4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。6.3PCR扩增产物电泳检测称取1.5g琼脂糖于100ml电泳缓冲液中，加热，充分溶化后，加人溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml.，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将8μl各PCR扩增产物分别和3μL加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。6.4　测序当电泳结果出现可疑阳性时，将PCR扩增产物进行DNA测序。7 结果判断与表述7.1PCR扩增产物电泳并序列分析实验在阳性对照出现131bp大小的条带，阴性对照无该条带出现、空白对照无条带出现时，视为该实验成立。在实验成立的前提下，样品出现131bp左右大小的扩增产物则判为可疑阳性，否则为阴性。将可疑阳性的PCR扩增产物进行核酸序列测定，与G