NY_T 2287-2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2287—2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification for Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Fang et al.)Swings et al.2012-12-24 发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2287—2012前言本标准按照GB1.1给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、江苏省植物保护站、南京农业大学。本标准主要起草人：王福祥、龚伟荣、胡白石、刘慧、褚姝频、李潇楠、胡婕、朱莉。I NY/T2287—2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法1范围本标准规定了农业植物检疫中水稻细菌性条斑病菌检测鉴定的技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病的检测金定2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少甲。LB且期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文用文件，其必威体育精装版版本（包BLISHING件。凡是不注日期的引本文件分析实验室用水规GB/T6682试验方法A水稻种产GB8371—2009租RESE农业植疫规程GB155692009物调运I3原理S条斑病是生物水稻细菌性条为害水稻的重要细菌病害，属国内植物检疫性有水稻细菌性条斑病落形态牛菌的田间症状、特征、致病性测试、血清学反应和/PCR反应等特征是检测与鉴定的的重要依据。RCR4试剂与材料C无水磷酸氢钠（NaHPO）、无水磷酸氢二钾（KHPO.）、无水磷酸氢钾（KHFPO)、碳酸钠氢钠（（NazCO3）、碳酸NaHCO、氯化钠（NaCI）、氯化钾（KCI）、氯化镜MgCl水亚硫酸钠化钠SVaO)、氢氧化钾（KOH)碘化钾（(NazSO）、氢gso.氧硫酸镁（MZHaO)、叠氮化钠(NaN3）、草酸NH市售抗体磷酸二钠（PNPP）、无菌水售酶标抗体、市20、对硝基本市Z售PCR试剂等剂与培养基，参见附录 A。需的其HRT所首试除另有规定为分析纯或生化试剂。T968外.实验用水应符合GE级水的规格。ERU5仪器及用具人超净工作台、电子、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、生物显镜、体式显微镜、小型粉碎机、高速台式离心机、酶标仪、电泳仪、紫外分光光度计、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器或纯水器、恒温干燥箱、微量移液器等。6取样方法6.1叶片取样田间发现水稻细菌性条斑病典型或疑似症状的叶片时（见附录B)，直接采样检验。6.2种子取样对调运中的种子，按照GB15569一2009中6.2的要求抽样。7检验鉴定7.1症状识别在水稻生长期按照GB8371一2009中8.1的要求进行田间调查，与水稻细菌性条斑病为害的典型症状进行比较（见附录B)，符合典型症状的可进行症状鉴定。如发现疑似症状，可采用常规鉴定、1 NY/T2287—2012ELISA检测以及PCR检测。7.2常规鉴定7.2.1菌溢检查切取田间采回的植株叶片病健交界处约20mm²，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。7.2.2分离培养在无菌条件下选取疑似症状叶片病健交界处组织约（3mm~5mm）×（3mm~5mm），用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次～3次后放人0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，在室温下浸泡10min～30min。将悬浮液在NBY培养基平板上划线，重复3个～5个平板，（27士2)℃培养3d～5d，观察并记录病原菌形态特征和培养特性（见附录B)。7.2.3革兰氏鉴定挑取少量分离到的病原菌配制成悬浮液，进行革兰氏染色法染色或3%KOH溶解试验（参见附录C)，观察记录病菌的形状、大小和染色反应。7.2.4致病性鉴定将分离培养得到的纯培养菌株，用无菌水配制细菌悬浮液（10°cfu/mL），用无菌接种针针刺接种于感病水稻品种叶片中部，每张叶片针刺2个点～3个点，每株接种2片叶～3片叶，接种10株。接种植株套袋保湿24h，12h光照/黑暗的循环条件下30℃培养，接种48h～72h后观察并记录水稻植株发病情况。7.3ELISA检测水稻细菌性条斑病ELISA检测程序参见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。7.4PCR检测水稻细菌性条斑病常规PCR检测程序参见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。8结果判定和报告8.1结果判定8.1.1症状识别判定田间植株发病症状符合附录B描述的水稻细菌性条斑病典型症状，判断为水稻细菌性条斑病。8.1.2常规鉴定结果判定镜检有菌溢现象，分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录B)，革兰氏染色阴性，致病