NY_T 2059-2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法.pdf

ICS 65.020B 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法Technical specification for the detection of rice stripe virus in smallbrown planthopper-Dot immunobinding assay2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部-发布 NY/T言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：周益军、周彤、范永坚、程兆榜。I NY/T2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法1范围本标准规定了灰飞虱携带水稻条纹免疫斑点检测方法。本标准适用于灰飞虱携带水稻条纹病毒的检测。2原理硝酸纤维素膜在中性条件下有效地吸附生物大分子，将抗原吸附于硝酸纤维素膜后，进行抗原抗体反应，当抗体与膜上的抗原结合后，通过再次结合有标记的抗抗体，经底物作用使斑点着色。3试剂除非另有说明，均使用分析纯试剂，水为蒸馏水。3.1碳酸钠(Na2CO3)3.2碳酸氢钠(NaHCOs)3.3氯化钠(NaCI)3.4氯化钾(KCI)3.5石磷酸二氢钾(KH2PO4)3.6磷酸氢二钠（Na2HPO）3.7盐酸(HCI)3.8无水乙醇(EaOH)3.9过氧化氢(H202)3.104-氯-1-萘酚3. 11吐温20(Tween-20)3.12脱脂奶粉3.13小牛血清蛋白(BSA)3.14辣根过氧化物酶3.15磷酸盐缓冲液（0.02mo1/L）：准确称取40.00g氯化钠（3.3）、1.00g氯化钾（3.4）、1.00g磷酸二氢钾（3.5)和15.00g磷酸氢二钠（3.6)于2500mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸（3.7)调节pH至7.5，4℃保存：3.16磷酸盐吐温20缓冲液（0.01mo1/L）：准确称取40.00g氯化钠（3.3），1.00g氯化钾（3.4）、1.00g磷酸二氢钾（3.5）和15.00g15.00g磷酸氢二钠（3.6)于5000mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸（3.7)调节pH至7.5，再加人2.5mL吐温20(3.11），4℃保存。3.17包被缓冲液（0.05mol/L）：准确称取1.59g碳酸钠（3.1)和2.93g碳酸氢钠（3.2)于1000mL的容量瓶中加水定容至刻度，用盐酸（3.7)调节pH至9.6，4℃保存。3.181%脱脂奶粉封闭液：准确称取1.00g脱脂奶粉（3.12)加入100mL磷酸盐吐温20缓冲液（3.16），混匀后4℃保存。3.192%小牛血清蛋白封闭液：准确称取0.2g小牛血清蛋白(3.13)加100mL磷酸盐吐温20缓冲液（3.16），混匀后4℃保存。1 NY/T 2059--20113.20辣根过氧化物酶固体显色底物溶液：准确称取6.00mg4-氯-1-萘酚（3.10），于2mL无水乙醇（3.8）中，4℃保存备用，使用时加入10mL磷酸盐缓冲液（3.15），再加人10μL过氧化氢（3.9）。3.21单抗：效价为1：10000，-18℃保存。3.22二抗：效价为1：5000，一18℃保存。4仪器设备4.1台式离心机。4.2加盖塑料离心管：200μL。4.3恒温摇床。4.4玻璃培养皿。4.5塑料盒：长100mm、宽50mm、高度10mm~50mm。4.6硝酸纤维素膜。5标准程序5.1灰飞虱的准备选择2龄以上单头灰飞虱置于离心管中，用牙签捣碎后加100μL包被缓冲液，离心（5000r/min）3min，取上清液（灰飞虱提取液）备用。5.2封闭预先用铅笔将硝酸纤维素膜划成5mm×5mm的正方格，取3uL灰飞虱提取液点于硝酸纤维素膜中央（以不超出正方格一半为准），同时取3L提纯的水稻条纹病毒（也可用已采用本方法测定为阳性的带毒灰飞虱提取液)和3μL的蒸馏水分别点于硝酸纤维素膜上预先标记好的正方格内，分别作为阳性对照和阴性对照，室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养血中，再加入1%脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白封闭液至膜完全浸没，于37℃摇床上摇晃30min。5.3孵育将水稻条纹病毒单克隆抗体和封闭液按比例（1：20000～1：40000）配制孵育液，弃去封闭液后将膜完全浸人孵育液，于37℃摇床上孵育1h～1.5h，弃去孵育液，再加人磷酸盐Tween-20缓冲液（3.16），将膜完全浸没于摇床上摇晃3min～5min，倒弃洗液，并重复洗膜3次。5.4二抗孵育倒弃洗液，以辣根过氧化物酶（3.14)标记的二抗和封闭液按比例（1：2500）配制孵育液，将膜完全浸人二抗孵育液，于37℃摇床上孵育