SNT 2039-2007地中海实蝇检疫鉴定方法 PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2039--2007地中海实蝇检疫鉴定方法PCR 法Identification of Mediterranean fruit fly ,Ceratitis capitata (Wiedemann)PCR protocol2008-07-01实施2007-12-24 发布中华人民共和国15发布RS国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2039—2007前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨伟东、余道坚、胡学难、康林、陈枝楠、仲建忠、章桂明、徐浪。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2039—2007地中海实蝇检疫鉴定方法PCR 法范围本标准规定了地中海实蝇常规PCR 和 SYBR Green实时荧光 PCR鉴定方法。本标准适用于进境水果、茄科蔬菜（包括番茄茄子和辣椒等)及包装物、土壤等的检验检疫中对地中海实蝇卵、幼虫、蛹和成虫的种类鉴定。 规范性引用文件2下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注明日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法(neq_ISO.3696)3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1SG-PCR SYBR green real-time-PCRSYBRGreen 实时荧光 PCR13.2dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。3.3MCA melting curve analysis溶解曲线分析。3.4Taq 酶栖热水生菌 DNA聚合酶。3.5COI cytochrome oxidasel细胞色素氧化酶 I亚基。3.6Ct threshold cycle循环阈值。原理4 实蝇样本(卵、幼虫、蛹或成虫)经过提取总基因组 DNA后，利用设计的特异性引物，通过常规 PCR和SYBR Green 实时荧光 PCR（SG-PCR）技术，特异性扩增地中海实蝇mtDNA COI基因片段（343bp），根据PCR扩增结果（常规PCR通过产物凝胶电泳结果；SG-PCR通过扩增曲线和溶解曲线），1 SN/T 2039-—2007判定实蝇标本的种类是否是地中海实蝇。特异性引物是通过比对地中海实蝇与腊实蝇属中的纳塔尔实蝇、非洲芒果实蝇，按实蝇属中的加勒比按实蝇、墨西哥按实蝇，以及绝大多数果实蝇的 mtDNA COI 基因片段设计出来的。5 仪器5.1 PCR扩增仪。5.2实时荧光PCR仪。5.3 电泳仪。5.4紫外分光光度计。5.5 凝胶成像系统。5.6低温冰箱。5.7 冷藏冷冻冰箱。5.8 水浴锅。5.9 离心机。5.10电子天平。5.11↑微量加样器(0.5 μL、2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)。6 试剂6.1　实验用水(应符合 GB/T 6682中一级水的规格）。6.2：蛋白酶 K(20 mg/mL)。6.3 RNA消化酶。6.4EDTA(0.5 mol/L,pH8.0).6.5TE(pH 8.0)。6.610XLoading Buffer（电泳上样缓冲液）。6.7 Ladder DNA Marker.6.8琼脂糖。6.9 DNA 染色剂。昆虫基因组 DNA 提取试剂盒。6.106.111DNA快速纯化/回收试剂盒。6.12 70%和99.99%乙醇。酚、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇等有机试剂,有机试剂如未有特殊说明,均为分析醇。6. 13PCR 试剂盒L包括10XPCR 缓冲液、Mg²+（25 mmol/L)、dNTP(2.5 mmol/L)］。6.146. 15Taq 酶。6.162 2XSYBR Green Master Mix.6.17 弓引物(10 pmol/μL)。7检测方法7.1实蝇标本的前处理用于分子生物学试验的实蝇样本使用前应长期冷藏在一4℃冰箱。所有实蝇标本在 DNA 提取之前均要作前处理，卵、幼虫、蛹、成虫或部分组织等实蝇样本要用无菌水冲洗数遍，晾干；干标本、乙醇和福尔马林浸泡的标本先用 TE(pH 8.0)浸泡处理1 h～2h。2 SN/T 2039--20077.2实蝇基因组 DNA 提取7.2. 1 试剂盒法将实蝇样本移人1.5 mL离心管或碾钵中，捣碎或加人液氮碾磨，之后实验步骤根据试剂盒的操作说明书操作。实蝇基因组 DNA溶液置一20℃冷冻保存。7.2.2 酚-三氯甲烷法将单头实蝇样本移人 1.