ELISA实验步骤分析和总结.docxVIP

实验步骤（以处理小鼠血清样品为例）：通用版 血清处理：将收集的小鼠血液样品室温静置 40min~1h 后（不要超过 1h），放在冰上待处理（不要超过 4h），或者及时离心处理。静置待血液析出血清后， 3000rpm （1000g）， 4℃，10min 离心，离心后应呈现上层为无色或淡黄色透明血清，下层为凝集的红色血团。若上层血清呈现淡粉色或红色，则表示该血液样本溶血，血清颜色越深则表示溶血程度越高。吸取血清时若不小心吸到下层红色部分，则沿壁缓慢打回原 EP 管，过度机械损伤会造成溶血。用 1.5mlEP 管，可按吸出的血清量加入等体积的 0.1M 的盐酸，即样品中 HCl 的终浓度为 0.05M。若血清量很大，则最好按实验需要分装成小管，避免血清反复冻融，然后冻存于 -80℃备用。若做 Elisa 实验，则取出所需要量的血清，待融化后再 1:1 加入等体积的 0.05M 的 HCl，既将血清稀释了 4 倍，HCl 的终浓度仍然为 0.05M，混匀后低速离心备用。 取出整盒 ELISA kit （保存于 4℃冰箱）放在 37℃培养箱预热 0.5h 至常温， 将摇床温度调至 31℃，转速为 150 转/min。 用已灭菌的 MQ H2O，稀释 10XHRP wash buffer 至 1X。 取出所需数量的 wells，放在 96 孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺 8 层左右，比底板略大即可。1X HRP wash buffer 300ul/well， 沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。加完后用手轻微震荡 5s，迅速翻转， 将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗 3 遍，保证每孔湿润。此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。 在空白和标准品的 wells 里，加入 20ul Matrix solution。空白对照设置 1 孔即可，标准品为 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/ml 六个 wells。 在标准品的 wells 里加入 10ul Assay Buffer,在空白和样品的 wells 中，加入 30ul Assay Buffer。 在标准品的 wells 里加入 20ul 标准品，在样品的 wells 中，加入 20ul 处理好的样品。 加入 Detection Antibody 50ul/well， 若孔内有气泡，可用注射器的针头轻轻 戳破，但注意不要碰到杯内液体，避免不同孔内污染。 盖上贴纸， 用手轻轻震荡 5s，略混匀，注意不要将液体弹到贴纸上。放入平板摇床，31℃( 温度过低会降低反应速率)150 转/min，反应 2h 轻轻揭掉贴纸，防止杯内液体弹出粘在贴纸上，甩掉 wells 内的液体，并在纸巾上拍打，用 1X wash buffer 洗 3 次，300ul 每次。最后一次要倒净杯内液体 （否则背景很高）。 Enzyme solution 100ul/well, 轻轻震荡混匀。盖上贴纸，放在平板摇床上，31℃ 150 转/min，反应 30min。 轻轻移除贴纸，甩掉 wells 内的液体，用 1X wash buffer 洗 6 次，300ul 每次，洗完后用酒精喷湿的纸巾将 wells 的底部擦干净透明，不要留纸屑和水渍， 以免影响后来酶标仪的读值。加入第 6 遍的 wash butter 后，先不倒掉，保证孔内湿润的情况下，到公共实验室开启酶标仪，确保其可用。再回实验室倒掉孔内液体，并拍打干净。 加入 Substrate solution 100ul/well， 轻轻震荡混匀， 盖上贴纸， 平放入不透明袋子中，注意平稳不让液体黏在贴纸上，放入在平板摇床上，31℃ 150 转 /min，反应 15min（孔内液体会变蓝，标准品蓝色随浓度升高而逐渐升高）。（如果颜色过淡，可适当延长时间）。 加入 Stop solution 100ul/well ，明显可见到孔内液体由蓝色变为黄色。加完后轻轻震荡混匀，使其充分反应。在 5min 内用酶标仪分别在 450nm 及590nm 波长下读吸光度（程序为事先设定好的）。 空白值为空白 well 的 450 读数减去 590 读数。其余 wells 的值为 450 读值减去 590 读值，再减去空白值。做出标准曲线后，再用所得公式计算样品中ghrelin 的含量。