SN 1676-2005山羊关节炎-脑炎病毒分离试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1676—2005山羊关节炎-脑炎病毒分离试验操作规程Protocol of isolation for the caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV)2005-09-30 发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准山羊关节炎-脑炎病毒分离试验操作规程SN/T 1676—2005*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*印张 0.5字数８千字开本880×1230 1/162006年1月第一次印刷2006年1月第一版印数 1—2 000 SN/T 1676—2005前言本标准主要依据国际兽疫局OIE《陆生动物诊断试验和疫苗使用手册》第5版(2004)的有关内容编制而成。本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈书琨、秦智锋、范万红、曾少灵。本标准是首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1676-—2005山羊关节炎-脑炎病毒分离试验操作规程1. 范围本标准规定了山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)的分离试验方法。本标准适用于山羊关节炎-脑炎的诊断。2.规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1171.1—2003山羊关节炎-脑炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验3原理将原代或传代山羊胎儿关节滑液囊膜(GSM)细胞或绵羊脉络丛(SCP)细胞（传代次数少于15代），与怀疑感染 CAEV的活动物病料,如感染关节腔的内容物、乳汁、外周血液中的白细胞共培养。动物死亡后，最容易的病毒分离方法是把感染组织(例如肺、脉络丛、滑液囊膜或乳房)进行移植培养。也可以从宰后的肺脏中收集巨噬细胞与敏感细胞进行共培养。其特征性的细胞病变(CPE):出现树枝状、能折光的星状细胞或合胞体。CAEV的存在与否可以用免疫标记方法或电镜镜检法来进行确证。4仪器与材料4,1 CO, 培养箱。4.2灭菌手术剪。4.3无菌平皿。4.425 cm² 细胞培养瓶。4.5无菌吸管(5 mL、10 mL)。4.6培养基过滤除菌系统。5 .标准毒株与试剂本标准所用化学试剂除另有特殊规定外,均为分析纯。5.1 CAEV标准毒株。5.2培养液5.2.1抗菌素贮存液：配制见第A.1章。5.2.2细胞生长液:配制见第 A.2 章。5.2.3细胞维持液：配制见第A.3章。5.2.4Hanks平衡盐溶液(HBSS):配制见附录 A.4。5.3指示细胞 SN/T 1676--2005CAEV可在多种来源于山羊和绵羊的细胞中生长,其中以 GSM 细胞或 SCP细胞最为适宜。指示细胞可自行制备，或由权威机构提供。GSM细胞或 SCP细胞可以从胎羊或新出生而未感染本病的羔羊制备，繁殖4代～5代后贮存于液氮中。复苏的细胞在传代10代～15代之前均可用于共培养。尽管SCP细胞在传代10 代～15代后仍生长很好，但对CAEV:的敏感性降低。5.4病料的采集5.4.1活动物病料的采集对于疑似CAEV感染的活山羊，无菌条件下采集外周血、泌乳期的乳汁、或者关节腔的抽取液，从中制备白细胞。5.4.2动物户体病料的采集无菌操作收集尽可能新鲜的可疑组织样品，如肺、滑液囊膜、乳房等，放人无菌的HBSS或细胞生长液中。从肺泡冲洗物(死后气管-肺泡冲洗物)中较易制备肺泡巨噬细胞，肺泡巨噬细胞可以与‘GSM细胞或 SCP 细胞共培养,分离 CAEV 病毒。6 操作步骤6.1 GSM 原代细胞和继代细胞培养GSM原代细胞和继代细胞培养见SN/T 1171.1--2003的附录 A。6.2活体样品的细胞培养6.2.1外周血中白细胞的制备外周血可用肝素钠、乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸盐抗凝，1000×g离心15min。吸出上层淡黄色的白细胞于一新的无菌离心管中,用 HBSS重悬。400Xg离心40 min,吸弃上清液。吸取界面细胞，于一新的无菌离心试管中，用 HBSS重悬，以 100Xg离心10 min。用细胞生长液重悬白细胞，制成约6×106个细胞/mL细胞悬液。6.2.2乳汁中白细胞的制备按6.2.1方法进行离心、洗涤、重悬。6.2.3白细胞的培养将制备的白细胞悬液置聚四氟乙烯袋（T