SN 1311-2003马尔堡病检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1311---2003马尔堡病检测方法Protocol of detecting methods for marburg disease2004-02-01实施2003-08-18 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1311--2003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张鹤晓、刘环、刘艳华。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。一 SN/T 1311--2003马尔堡病检测方法1 范围本标准规定了马尔堡病检测方法。本标准适用于马尔堡病抗体水平的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2. 1ELISA酶联免疫吸附试验。2.2IF免疫荧光试验。2.3MBG马尔堡病。2. 4PBS磷酸盐缓冲液。2. 5TCIDs半数细胞感染量。2. 6CPE细胞病变效应。2.7OD 值光密度值。3 原理3.1 IF 试验将感染 MBG病毒的细胞固定在带圈的载玻片上，在特异性抗体存在时，利用抗原抗体反应具有高度特异性这一特点，再加上荧光色素标记的二抗，与结合在抗原上的抗体结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。3.2 ELISA 试验将抗原包被在酶标板上，在特异性抗体存在时，抗原抗体结合，再加人酶标二抗，形成抗原抗体酶标二抗复合物。复合物中的酶在}到相应的底物时，催化底物分解，产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度，间接推测抗体是否存在以及其效价。4试剂和材料试剂和材料的准备如下：-MBG病毒：由指定单位提供；包被用重组核蛋白抗原：由指定单位提供；阴、阳性血清：由指定单位提供；一细胞抗原片：由指定单位提供或自制；1 SN/T 1311—2003被检血清：用真空管采集血液,无菌分离血清，一20℃保存。用前 60℃灭活 1 h;一酶标二抗：由指定单位提供；一底物溶液：由指定单位提供；-荧光素标记二抗：由指定单位提供；—细胞：Vero 细胞;-细胞营养液、维持液、细胞分散液、包被液、洗涤液、稀释液、终止液、PBS的配制见附录A。5器械和设备器械和设备的准备如下：荧光显微镜；酶标仪；-96孔酶标板；-带圈载玻片；一单道和多道可调微量移液器20 μL～200 μL;-温箱;倒置显微镜；一冰箱。6操作方法6.1 IF 试验6.1.1细胞抗原片的制备将 Vero细胞培养成单层，用无菌 PBS洗一遍，接种 104 TCIDso/0.05 mL～10 TCID5o/0.05 mL量的MBG病毒,6 d后,20%～40%感染细胞出现 CPE,倒掉液体,用细胞分散液漂洗一次,加人细胞分散液，37℃作用3min～5min，待细胞开始脱落前将分散液倒掉，（150mL细胞瓶）加人10 mLPBS（含5%犊牛血清,防止细胞成团）,用吸管用力吹打。取5 mL细胞悬液加到直径 10 cm 的平Ⅲ内，紫外线照射20min灭活病毒,将细胞悬液稀释成1.2×10°个细胞/mL，在带圈载玻片上每孔加0.015mL,保证大多数细胞未感染，少部分细胞为带毒细胞。将载玻片空气干燥后，丙酮固定 10 min，放在塑料袋内,°Co 照射(200 000 rads),以消除病毒的传染性,后保存于70℃备用。以上步骤必须在生物安全IV级实验室内进行。6. 1.2正式试验取出细胞抗原片,温至常温。将待检血清和阴、阳性血清用 PBS 作 1：2、1 ：4、1 ：8 等倍比稀释,加到细胞抗原片上，每个稀释度的血清加两孔，量以不溢出为宜，置湿盒内，37℃感作 30 min,取出用PBS冲洗三遍，加用PBS作(1：10)～（1：50)稀释的荧光素标记二抗（内含伊文斯兰 1：1000)，置湿盒内，37℃感作30 min，取出用PBS冲洗三遍，空气干燥后，用pH9.0的碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。6.2 ELISA 试验6.2.1包被按照提供的重组核蛋白抗原所附说明书要求，用包被液将抗原稀释，包被96孔板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜。6. 2.2血清稀释将待检血清和阴、阳性血清用稀释液作1：400至1：6400的倍比稀释。6.2.3加样取出96孔板，用洗涤液洗涤三次，每孔加100μL稀释血清，每个稀释度的血清加两孔，37℃感作2 SN/T 1311—20031 h.6.2.4洗涤倒掉血清，用洗涤液洗涤三次,每次 5 min。6.2.5 加酶标二抗用稀释液将酶标二抗按说明书要求稀释,加到96孔板内，每孔100μL,37℃感作1h。6.2.6洗涤倒掉酶标二抗,用洗涤液洗涤三次,每次 5 min。6.2.7 加底物每孔加100 μL底物溶液，酶标板置暗盒内15min。6.2.8加终止液取出酶标板，每孔加50μL终止液。6