SN_T 3492-2013传染性肌肉坏死检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3492—2013传染性肌肉坏死检疫技术规范Quarantine protocol for infectious myonecrosis2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局W.O3815刮涂层查真优 SN/T 3492—2013前言本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准参考了OIE《水生动物疾病诊断手册（2011年版）》第2.2.3章，选取OIE手册中临床诊断内容和分子诊断中关于反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应检测方法的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院本标准主要起草人：兰文升、郑晓聪、史秀杰、黄继徽、唐连飞、贾鹏、王津津、叶奕优、王红英。 SN/T 3492—2013传染性肌肉坏死检疫技术规范1‧范围本标推规定了传染性肌肉坏死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV)的反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应的检测方法。本标准适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectious_myonecrosis,IMN)的检疫和诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1反转录-聚合酶链式反应 reverse transcriptioh polymerase chain reaction ; RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下,在适宜反应条件下，被逆转录成 cDNA，以cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。3.2real-time RT-PCR实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应在常规RT-PCR的基础上|加人一条特异性的荧光探钎，荧光PCR仪器的监测系统可以接收到条DNA链，就有一-个荧光分子形成，使荧光信号的累积与PCR产物PCR反应中的荧光信号，每扩增形成完全同步。3.3Ct 值 cycle thresholdReal-time RT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4主要试剂和材料4.1除特别说明外，本标准仅使用确认为分析纯的试剂。4.2水：应符合 GB/T 6682中级水的规定。4.3 Taq 酶:一20 ℃保存。4.4 反转录酶：一20℃保存。4.5RNase 抑制剂：20 ℃保存。4.6T7 RNA聚合酶：-20℃保存。4.7 DNase I-20 ℃保存。 SN/T 3492-20134.8 pGEM-T Easy Vector:-20 ℃保存。4.9Pstl限制性内切酶：一20℃保存。4.10 NTP:含 CTP、GTP、ATP、TTP各 2.5 mmol/L的混合物，一20 ℃保存。4.11dNTP:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各 10 mmol/L.的混合物，一20 ℃保存。4.12　引物浓度为20 μmol/I，一20℃保存，其序列如下：正义引物(IMNV218F):5-GCT GGA CTG TAT TGG TTG AG-3;反义引物(IMNV682R):5-AAC CAA GTT CTT CTT CTC CAG TT-3;正义引物(4587F):5-CGA CGC TGC TAA CCA TAC AA-3;反义引物(4914R):5-ACT CGG CTG TTC GAT CAA GT-3;正义引物(4725NF):5-GGC ACA TGC TCA GAG ACA-3;反义引物(4863NR):5-AGC GCT GAG TCC AGT CTT G-3;正义引物(IMNV412F):5-GGA CCT ATC ATA CAT AGC GTT TGC A-3;反义引物(IMNV545R):5-AAC CCA TAT CTA TTG TCG CTG GAT-3;探针(IMNVp1):5-6FAM-CCA CCT TTA CTT TCA ATA CTA CAT CAT CCC CGG-TAMRA-3;引物用无RNA酶的去离子水配制成100μmol/L的储备液，在使用过程中根据需要配制不同工作浓度。4.13病毒RNA抽提试剂盒或其他抽提RNA的等效产品。4.14溴化乙锭（EB）。4.15溴酚蓝DNA上样液（见附录A）。4.16TAE电泳缓冲液（见附录A