SN_T 3506-2013布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3506—2013布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程 Procedure of fluorescence polarisation assay for brucellosis2013-09-16实施2013-03-01发布中华人民共和国发布D国家质量监督检验检疫总局H0ESOR2奇护 SN/T 3506-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、栾慎顺、柴铭骏。1 --SN/T 3506—2013布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程1范围本标准规定了布氏杆菌病荧光偏振试验技术要求。本标准适用于布氏杆菌病的检疫、筛查和监控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由经过生物安全培训的工作人员进行布氏杆菌病的检测，应当采取预防气溶胶感染的安全措施。所有废弃物应按照GB19489中的有关规定处置。4试验原理溶液中的分子作随机转动。分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系。因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和垂直的偏振光强度来确定。因而，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光诊断布氏杆菌病时，布氏杆菌光滑型LPS的小分子量片段OPS（平均22.kD)，标记上异硫氰荧光素(FITC)，用作抗原。然后加到待检血清中，若有抗体，与标记抗原结合后就会降低其转动速度，用荧光偏振仪器测定出偏振值，通过偏振值判定样品的阴、阳性。5试剂和材料5.1阳性对照：布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。5.2阴性对照；布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。5.325×浓缩的反应缓冲液：布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。5.4结合物：标记有异硫氰荧光素的O型多糖(OPS)抗原,布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。5.596孔黑色平底微量板。5.6除另有规定，本方法试验用水应使用符合GB/T6682规定的三级水。6仪器和设备6.1荧光偏振仪。 SN/T 3506—20136.2微量板振荡器。6.3温箱:温度范围应满足16℃～26℃。7被检样品被检样品为血清样品。样品应避免含有颗粒物，如出现颗粒物应作离心处理。溶血样品可用于本试验，冻干样品应用蒸馏水进行复原，冷冻样品需完全融化并混匀。8操作方法8.1将试剂和样品恢复至室温（16C～26℃）。8.2将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水作1：25稀释。制备稀释的反应缓冲液应避免有颗粒物、配制后的溶液放置室温保存,并在 1个月使用。8.3取20μL阴性对照加人微量板A1、B1、C1孔中,取20L阳性对照加人微量板D1孔中，取20μL血清样品加人其余相应孔中。在向微量板加样或加液休时应避免气泡产生。8.4取180μL稀释的反应缓冲液加人到微量板的每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min。8.5将反应板置室温（16℃～26℃孵育 3min～5mmin后-罩荚光偏振仪（激发波长 485nm，发射波长528nm）上读取缓冲液和样品的初始值，作为空自偏振值。8.6取10μL结合物加人到每个反应孔中，置振荡器上中速拆荡2min。8.7将反应板置室温（16℃～26℃)孵育2-min~3-min,置荧光偏振仪上读取最终偏振值。9结果判定对照或样品的偏振值计算见式（1）：FP(1)式中:FP一一对照或样品的偏振值,mP;A对照或样品的最终偏娠值,mPB一对照或样品的初始偏振值，mP。当阳性对照的偏振值在120mP250mP之闻阴性对照的偏振值在70mP～95mP之间时，方可进行被检样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超出规定的范围，需要根据仪器手册的说明重新校正仪器。结果判定计算见式(2）：FP C:( 2)式中:△一样品的偏振值与阴性对照平均偏振值的差值,mP;FP—对照或样品的偏振值,mP;C 一-阴性对照平均偏振值,mP。被检样品为牛血清时,△10 mP,样品判为阴性：10 mP≤△≤20 mP,样品判为可疑;A20 mP,样品判为阳性。被检样品为羊血清时,△10 mP,样品判为阴性;10mP≤△≤15mP,样品判为可疑;△15 mP,样品判为阳性。被检样品为猪血清时,△10 mP,样品判为阴性;10 mP≤△≤20 mP,样品判为可疑;△20 mP,样2 SN/T 3506—2013品判为阳性。可疑样品应双份重复试验。如果两次样品的△均小于10 mP,判