SN_T 3681-2013魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3681-2013魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems,et al08-30发布2014~03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3681-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：甘琴华、厉艳、邵秀玲、封立平、刘彩霞、王英超、赵晖、李凤新、纪瑛一 SN/T 3681-2013魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3魔芋细菌性叶斑病菌基本信息学名:Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems, et al. 1992.异名: Pseudomonas avenae subsp. konjaci(Goto, 1983) Hu, et al., 199l; Acidovorar avenaesubsp. konjaci; Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. konjaci Goto 1983.分类地位：原核生物界（Procaryotae）、薄壁菌门（Gracilicutes）、暗细菌纲（Scotobacteria）、假单胞杆菌目（Pseudomonadales）、假单胞杆菌科（Pseudomonadaceae）、嗜酸菌属（Acidovorar）。传播途径：带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室，主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播，由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。4　方法原理根据症状现场采集病样，实验室开展分离培养纯化，及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测，鉴定特征吻合，检测结果为阳性的，判定为魔芋细菌性叶斑病菌。5仪器用具和主要试剂5.1仪器及用具生物显微镜、具透射光源的体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高压灭菌器、酒精灯、培养Ⅲ（直径：7.0和9.0cm）、医用注射器（10 mL）、针头（18号）、医用手术剪、镊子、解剖刀、烧杯（500 mL）、试管（直径12mm）、载玻片、盖玻片、量简(500 mL)。5.2 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。蒸馏水、蛋白陈、0.1%次氯酸钠或75%乙醇、PPSM培养基、1 SN/T 3681—2013YP培养基、金氏 B(KB)培养基。培养基配制方法见附录 B。6现场检测6.1　抽样块茎或植株按SN/T1157中的规定进行抽样。6.2 症状检查首先应查看植株是否萎，检查植株的根茎叶等各个部位，叶片是否有斑点、下垂，根、茎或块茎是否腐烂。如果发现上述任何一种症状,切取或将整棵植株取回实验室检验。7实验室检测7.1病原菌的分离培养7.1.1病原菌的分离用灭菌剪刀（或解剖刀)剪取可疑症状的植物组织，取表层组织切成约2mm²小块，先用75%的乙醇浸泡30s表面消毒，捞出后用无菌水洗3次，最后把病组织置放装有2mL1%蛋白陈水溶液的无菌离心管中，用无菌的玻棒捣碎，用无菌接种环蘸薰取汁液在PPSM平板上划线，28℃恒温培养2d～3d后,检查是否有菌落产生。7.1.2菌种纯化采用平板划线法，即用无菌的接种环蘸取穹隆状、金缘、中央部淡紫桃色、周边透明的菌落后，在YP或KB平板上多次划线纯化,28℃恒温培养2d～3d,移出单个菌落后进一步扩大繁殖。7.2革兰氏染色反应按GB/T4789.28—2003中的2.2进行实验。7.3生理生化测定分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任一方法进行。应用生化管或微量发酵管进行分离菌的生理生化测定。A.konjaci标准菌株革兰氏反应阴性，氧化酶反应阳性，能分解丙二酸，不能利用D-半乳糖、2-氮基乙醇。若上述特征符合则选取可疑菌落作进一步鉴定。应用BIOLOG全自动微生物