SNT 1918-2007牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1918—2007牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for infectious bovine rhinotracheitis2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国涂层技路10615查询真发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 :SN/T 1918—2007前言本标准参考了OIE《陆生动物疫病诊断试验和疫苗标准手册》。本标准的附录 A和附录B为资料性附录。!本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。本标准主要起草人：段宏安、张睿、姚燕林、王振国、周毅、王海涛、王伟利、李金华、刘小琴。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1918—2007牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程1范围本标准规定了牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应检测方法。本标准适用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO 3696:1987)GB/T18088出人境动物检疫采样SN/T 1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本标准3.1IBR infectious bovine rhinotracheitis牛传染性鼻气管炎。3. 2BHV1 bovine herpesvirus type牛疱疹病毒 1 型。3.3MDBK Madin-Darby bovine kidney cell line牛肾传代细胞系。3. 4PCR Polymerase chain reaction聚合酶链反应。3. 5BSA bovine serum albumin牛血清白蛋白。3. 6dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核糖核苷二磷酸。3.7dATP deoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。 SN/T 1918—20073.8dCTP deoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。3.9dGTP deoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸3.10dTTPdeoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。3.111bp base pair碱基对。13. 12ddH, O double distilled water双蒸水。3.13EDTA ethylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸。3.14Taq 酶 Taq DNA polymeraseTaq DNA 聚合酶。13. 15CPE cytopathic effect致细胞病变效应。4原理1牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛疱疹病毒 1 型(BHV1)引起的牛的急性病毒性传染病。患牛康复后仍可长期带毒，生殖系统感染后，病毒可在阴道及包皮粘膜中繁殖，精液中可能含有病毒。通过对采集病料的处理,提取病毒 DNA，以病毒 gB 和 gE基因片段为靶基因进行 PCR 扩增;琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,以确定样品中是否含有BHV1 病毒。5试剂和材料除另有规定外，水为双蒸水或超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格，并经过121℃、30min高压灭菌；试剂为分析纯或生化试剂。5.1琼脂糖(电泳纯)。5.2溴化乙锭（EB）。5.3三氯甲烷5.4　异戊醇。5.5 异丙醇。5.6 75%乙醇。5.7 正丁醇。1Taq酶：一20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。5.8DNA 分子量标准(DNA Marker）：50 bp～500bp,须在 250bp、500 bp 处各有一条带。5.92 SN/T 1918—20075.10PBS(pH7.2)溶液、红细胞裂解液、5%Chelex-100溶液、精子裂解液、TE缓冲液、dNTP、引物、10XPCR反应液、电泳缓冲液、10X加样缓冲液、溴化乙锭核酸染色液配制方法参见附录A。6主要仪器6.1 PCR扩增仪。6.2无菌室、超净工作台或通风橱。6.3消毒灭菌锅。6.4恒温水浴箱。6.5高速冷冻离心机。6.6台式小型离心机。6.7 低温冰箱,冷藏冷冻冰箱。6.8纯水器或超纯水器。6.9旋涡混合器。6.10移液器。6.11电泳仪。6.12紫外分析仪或凝胶成像系统。