SNT 1999-2007牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1999—2007牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程Protocol of antigen captured enzyme - linked immunosorbent assayfor bovine viral diarrhoea-muscosal disease2007-12-24 发布2008-07-01实施中华人民共和国发布AR国家质量监督检验检疫总局数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程SN/T 1999—-2007*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16字数 ８千字印张 0.52008年2月第一版2008年2月第一次印刷印数 1—2000书号：155066·2-18459 SN/T 1999---2007前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：董志珍、侯艳梅、赵祥平、肖妍、霍蕾。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1999—2007牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程1范围本标准规定了牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)操作方法。本标准适用于牛病毒性腹泻-粘膜病抗原的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696）3原理以边界病病毒特异性抗体包被酶标板，同时加入BVDV检测单克隆抗体及样品，样品即与两种抗体结合，形成抗原抗体结合物，洗板后再加人二抗（与抗原抗体复合物结合）及底物，通过测量光密度值而确定样品的结果。4试验材料牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获ELISA诊断试剂盒4.12℃～8℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒多克隆抗体包被板;a）b）抗BVDV单克隆检测抗体；c）。BVDV 阳性对照;d）BVDV 阴性对照;辣根过氧化物酶(HRP)标记的牛抗鼠抗体；e）f）10X样品稀释液；g)10×浓缩洗液；h)TMB底物溶液;i）乡终止液。4.2样品的处理4.2.1组织使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在2℃～8℃保存1个月或长期冷冻保存。组织样品最4.2. 1.1好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏。用剪子将 1 g～2 g的样品剪碎(2 mm～5 mm）。将剪碎的样品置于10mL的离心管中,加人 5mL样品稀释液（1×）,混匀,室温感作1h～2 h。1500 r/min离心10 min，吸取50 μL上清液作为检测用样品。按第7章进行试验。4.2.2外周血液白细胞 将肝素或 EDTA抗凝的血样 10 mL,2 000 r/min 离心15 min～20 min。1 SN/T 1999--200用1000uL移液器小心吸取血沉表层的淡黄色薄膜,重悬于500uL的样品稀释液中，每一个样品换一个吸头。室温放置1h,在此期间偶尔漩涡振荡一次，下面继续的操作。如果样品的压缩细胞体积非常小,那么用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到10 mL离心管中，并加入等体积的 2℃～8℃预冷的0.17 mol/I.的NH,C1溶液，放人离心管中，室温放置 10 min。将离心管用2℃～8℃预冷的超纯水（或双蒸水)加满,轻轻地翻转摇匀，2 500r/min离心5 min.弃去上清液，加人500μL样品稀释液（1×）到血细胞中，每个样品使用新的枪头涡动混匀，室温中放置 1h,在此期间偶尔漩涡振荡一次。2500 r/min，离心5min,用上清液作为检测样品，按第7.章进行试验。4.2.3　鼻拭子取下拭子头，放入底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空）。将微型离心管放人另一个Eppendorf 管中,2 500 r/min离心 弃去底部有小孔的微型管，并在Eppelendorf 管中加人与获得的粘液等体积的样品稀释液（1×）,混匀，室温下放置1h～2 h。此期间偶尔摇晃一下。然后可按第7章操作程序进行试验。4.2.4细胞培养物弃去细胞培养液，反复三涤冻融后，收集细胞培养液到离心管中，3000r/min离心5min，弃去上清液。加人500uL样品稀释液,振荡器上轻轻混匀，置于室温1h,吸取50uL作为