DB37_T 2760-2016鸭甲肝病毒血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法.pdf

1ICS 11. 220B 41DB37山長东省地方标准DB37/T2760—2016鸭甲肝病毒血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法Duplex RT-PCR detection method for duck hepatitis A virus type 1 and 32016-05-13发布2016-06-13实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2760—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学负责起草，山东省农科院家禽研究所、山东省畜牧兽医职业学院等参加起草本标准主要起草人：要世金、谢之景、宋训、刁有祥、李舫、张瑞华、陈君豪、陈琳琳、沈关艳。I DB37/T 2760—2016鸭甲肝病毒血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法1范围本标准规定了兽医实验室对两种血清型的鸭甲肝病毒（DHAV）即1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）进行双重RT-PCR鉴别的操作规程和技术要求本标准适用于鸭甲肝病毒血清1型和3型的快速鉴别诊断，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，NY/T554一2002鸭病毒性肝炎诊断技术SN/T 3464—2012鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范3实验室条件3.1仪器PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴锅等。3.2操作区域样品操作区要有相应的生物安全设施：RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度清净样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单一方间，不得倒流。电泳区与其他操作区域相互隔离。3.3操作者操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培训，4试剂的准备4.1试剂4. 1. 1RNA提取试剂盒4. 1. 2一步法RT-PCR试剂盒4. 1. 3：1%琼脂糖凝胶，见A.1.4.1.41XTAE缓冲液，见A.2。4.1.5溴化乙锭（10μg/μL），见A.34. 1. 65核酸电泳加样缓冲液，A.4.4.1.7DEPC 水，见A.5. DB37/T 2760—20164.1.9用已知的含有与RT-PCR检测引物（附录B）相对应的且灭活的1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒制作的阳性对照标准品。4.1.10用高压灭菌的蒸增水作为阴性对照标准品。4.2引物序列见附录B，浓度均为10μmo1/L。5操作程序5.1样品的采集和处理对临床发病怀疑感染鸭病毒性肝炎的病例无菌采集鸭肝脏样品，于-20芒保存。5.2设置对照对照。5.3RNA提取参照RNA提取试剂盒的说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测，否则应于-70C冻存。5.4RNA扩增体系的配制按照一步法RT-PCR试剂盒说明书要求，配制RT-PCR反应体系。总反应体系为50μL，其中DEPC水12.6μL，2×RT-PCR缓冲液25μL，RT-PCR酶混合物2μL，引物DHAV1F和DHAV1R（10 μmo1/L）各1.2μL，引物DHAV-3F和DHAV3R（10 μo1/L）各1.0 μL，待检样晶RNA 6 μL.如果同时进行多个样品的检测，可以按照上述比例，将待检的RNA以外的落液混合在一起，然后每个RT-PCR管中分别加入44μL此混合液，再加入6μL对应样品的RNA。5.5RT-PCR反应按照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，设置反应条件。第一步是RT，AV反转承酶最适反应温度是42C，NM-MLV反转永酶最适反应温度是37C，反转永时间是30min；第二步是灭活反转永酶，95C、3min：第三步是PCR，PCR反应条件为：95C5min95C50s，60C50s，72C40s，30个循环;72 C 10 min.5.6RT-PCR产物电泳RT-PCR结束后，每个RT-PCR管加入5μL核酸电泳加样缓冲液，密闭RT-PCR管，成分混合，然后每管取5叫L～10叫L加入1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于胶中央的加样孔中加入DNA分子量标准参照物.加样后，按照每厘米凝胶5V电压，电泳20min～40min。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察根据DNA分子量标准参照物判断RT-PCR扩增产物的大小，6结果判定2 DB37/T 2760—2016阳性对照出现相应大小的目的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效：否则判定检测结果无效，不能进行判断。按照如下条件进行判定：从样品中只扩增出了492bp的产物，则该样品为DHAV-1阳性，DHAV-3阴性从样品中只扩增出了286bp的产物，