NY_T 2288-2021CN黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法.pdf

ICS 65.020CCS B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T2288—2021代替 NY/T 2288—2012黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法Detection and Identification method of Cucumber greenmottle mosaic virus2021-05-07发布2021-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 2288—2021附录D(资料性）黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附测定D.1样品制备D.1.1种子取种子若干粒.去皮，加人样品提取缓冲液(W：V=1：8)研磨匀浆，5000r/min，4离心5min，保存待用。D.1.2叶片取叶片加人提取缓冲液(W：V=1：8)研磨匀浆。5000r/min，4℃离心5min，保存待用。D. 2包被将CGMMV的包被抗体按照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混匀，加人酶联板中，每孔内加人100μL，放人保湿盒内，放置37C中孵育4h。D. 3洗涤孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，用PBST洗涤液冲洗3次～4次，每次15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留波体。D.4加入抗原（待测样品）在酶联板中加人抗原（待测样品），同时加入阳性对照、阴性对照和空白对照（样品提取缓冲液）100L，待测样品重复3次，恒温箱中或室温下（25C)孵育2h，剩余样品于一20C冰箱保存备查，D.5洗涤按D.3执行。D.6加入酶标抗体将CGMMV的酶标抗体按照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混匀，加人酶联板中，混合均匀，于每个反应孔中加入100L，放人保湿盒内，室温（20℃～25℃)孵育2h。D.7洗涤按D.3执行。D.8加入底物试剂放人保湿盒内，室温（20℃～25℃）避光30min~60min，D. 99终止反应于每孔中加人50L终止液，终止反应D.10测定用酶标仪在405nm波长下测量结果，读取各孔落液的光密度值（OD值），记录结果，7 NY/T 2288—2021附录E(资料性）黄瓜绿斑驳花叶病毒逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定E. 1器血前处理为防止RNA酶降解RNA，器皿在试验前都要用DEPC水(V：V=1：1000)进行处理。将研体、枪头、离心管等放于DEPC水中37℃，浸泡24h，取出后121℃灭菌30min，烘干备用。E. 2总RNA的提取取显症的叶片在液态氮中充分研磨，转人1.5mL的离心管中，加人1mLTrizol试剂，室温下静置5min后加人200L氯伤，涡轮震荡15s，室温下放置5min12000r/min，4C离心15min，转移上清于一个新离心管中，加600μL异丙醇混匀后于室温下静置10min，12000r/min，4℃离心15min，例掉上清液，在沉淀物中加1mL75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室温干燥3min～5min，加人30μLDEPCddH,O溶解总 RNAE. 3RT-PCR反应体系E.3. 1引物序列(CGMMV-654F/R)上游引物(Primer F);5-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3’;下游引物(Primer R) ;5-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3”。E. 3. 2RT-PCR实验步骤E. 3. 2. 1cDNA合成按下列组分制备RT反应体系(20μL)，反应以加人不含RNA酶的ddH,O为阴性对照，反应条件为42C1h合成cDNA，70℃10min灭活反转录酶。反应体系见表E.1.表 E. 1RT反应体系反应组成体积-μlPrimer R(10 μmol/L)0. 510X RT Buffer2RNase free ddH, O13. 5dNTP Mixture(各 10 mmol/L)1RNase Inhibitor (40 U/μL)0. 5M-MLV Reverse Transeriptase0. 5RNA2E. 3. 2. 2PCR扩增在冰浴上依次将下列组分加人PCR反应管中，反应采用25L体系。反应条件为：94℃预变性3min、94C变性30s,53退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min，反应体系见表E.2。表 E. 2PCR反应体系反应组成体积pl5X PCR buffer5O°HPP13, 75TaKaRa EX TaqHS0. 2590 NY/T 2288—2021表E.2 (续)反应组成体积,plPrimer F(10 μmol/L)0. 5Primer R(10 μmol/L)0. 5RT 产物(cDNA)5E. 4RT-PCR扩增产物凝胶电泳检测取5μL扩增产物用6Xloadingbuffer溶解，点样，E电泳后用浪化乙锭（EB)溶液进行染色30m