DB37_T 2094-2012水产品中羟脯氨酸含量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.120. 30B 50DB37山 長东省地方标准DB 37/T产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法Determination of Hydroxyproline in Fishery Productsby High Performance Liquid Chromatography2012-03-21发布2012-05-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2094—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口，本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。本标准主要起草人：刘慧慧，张秀珍，徐英江，田秀慧，于召强，邓旭修。I DB37/T 2094—2012水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了水产品中羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法。本标准适用于水产品中羟脯氨酸含量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理用盐酸于110C水解试样，移释、过滤水解产物，羟脯氨酸经DABS-C1衍生后，用C18柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，外标法定量。试剂4.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯。4.2试剂主要包括：实验用水：应符合GB/T6682中一级水标准：乙睛：色谱纯：盐酸：无水乙醇：-N，N-二甲基甲酰胺：碳酸氢钠：氢氧化钠：柠檬酸：优级纯：磷酸二氢钠：二甲基要,基偶效苯硕酰x：DABSC1（4-Dimethylaminoazobenzene4-sulfony1 chloride），%86羟脯氢酸标准品：L-羟脯氨酸（L-Hyp），纯度≥99%：羟脯氨酸标准储备溶液：准确称取羟脯氨酸标准品0.1000g，用水溶解并定容至100mL。此溶液浓度为1.00g/L。4℃避光保存，有效期1个月：-羟脯氨酸标准中间溶液：移取羟脯氨酸标准储备溶液，用水逐级稀释至1.0mg/L。临用时配制：-0.1mo1/L碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠8.4g，用水溶解并稀释至1L；-2mo1/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠80g，用水溶解并稀释至1L： DB37/T 2094—20120.1mo1/L柠檬酸落液：称取柠檬酸21.0g，用900mL水落解，加2mo1/L氢氧化钠落液70mL，用2mo1/L氢氧化钠溶液滴定至pH6.4，用水定容至1L：-12mmo1/L柠檬酸溶液：量取0.1mo1/L柠檬酸溶液120mL，加N，N-二甲基甲酰胺40mL，用水稀释至1L:衍生试剂落液：称取DABS-C10.013g，用乙晴落解并定容至10mL，4C避光保存，有效期1个月：衍生反应终止液：配制50mmo1/L磷酸二氢钠溶液，用2mo1/L氢氧化钠溶液调至pH7.0，再加等体积无水乙醇：6mo1/L盐酸落液：取盐酸50mlL，加水稀释并定至100mL仪器与设备主要包括：高效液相色谱仪：配紫外检测器：天平：感量0.01g：电子天平：感量0.0001g：勾浆机：电热恒温干煤箱：恒温水浴：真空泵：酒精喷灯：微孔滤膜：0.45μm；涡旋混合器。6试样制备鱼，去麟、去皮，沿脊背取肌肉，将肌肉、鳞、皮单独收集：虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；蟹、贝、甲鱼、海参、海带等取可食部分，样品充分搅醇、混勾如不能及时检测，-18℃以下冷冻保存备用，7测定步骤7. 1水解称取适量勾浆后的样品于水解管中，使每管中含蛋白质约20mg，加入6mo1/L盐酸6ml，充氮气1min，抽真空至管内盐酸起泡，用火焰将管封口。于110℃水解22h，冷却后，将水解液全部转移到50mlL容量瓶中，加水至刻度，混勾后，根据样品中羟脯氨酸含量不同，分别取1mL5mL水解液于10mL容量瓶中，加2mo1/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5~7.5，加水移释至刻度，取1mL稀释液用0.45m滤膜过滤备用。7.2衍生取过滤后的稀释液30rL于1.5mL具塞离心管中，加0.1mo1/L碳酸氢钠溶液30μL，衍生试剂溶液60rL，凝涡混匀30s，70℃水溶中衍生反应，2min时取出激涡混匀1次，继续于70℃水浴中反应13min，反应结束后取出迅速冷却，加入衍生反应终止液630L，用0.45滤膜过滤，供高效液相色谱分析。2 DB37/T 2094—20127.3测定7. 3. 1色谱条件主要包括以下几项：a)色谱柱：MG-C18柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5μm，或与之性能相当者：b)流动相：A：12mmo1/L柠檬酸溶液（4.17）：B：30%A+70