NY_T 4041-2021CN水貂阿留申病诊断技术.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 4041—2021水貂阿留申病诊断技术Diagnostic techniques for aleutian mink disease2021-12-15发布2022-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 4041—2021目次前言引言范围规范性引用文件术语和定义缩略语.临床诊断5. 1临床症状5. 2病理诊断5. 3结果判定PCR检测6. 1仪器6. 2试剂6. 3AMDV明性对照和阳性对！样品的制6. 4样品的采集和处理6. 5操作方法6. 6质控标准6. 7结果判定实时定量PCR检测7. 1仪器7. 2试剂7. 3AMDV阴性对照和阳性对照样品的制各7. 4样品采集和处理7. 5操作方法7. 6质控标准7. 7结果判定CIEP检测8. 1仪器8. 2耗材8. 3试剂8. 48. 6操作方法质控标准结果判定ELISA检测9. 1仪器9. 2试剂9. 3包被抗原9. 4阴性对照和阳性对照样品的制各 NY/T 4041—20219. 6操作方法9.6.1包被用包被液稀释1mg/mLAMDV多肽抗原至2μg/孔，每孔100μL，包被96孔酶标板，封口后，4C包被12h，包被结束后，奔去孔内液体，每孔加入300μL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。9. 6. 2封闭每孔加入300μL的封闭液，置于37℃恒温培养箱孵育2h，过闭结束后，弃去孔内液体，每孔加入300μL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min，于吸水滤纸上拍干除去孔内残余液体。9.6.3加样用血清稀释液1：200稀释待检血清，每个样品一个重复，每孔加入100L，同时加入阴性对照和阳性对照血清各2孔，100xL/孔，置于37℃温箱孵育30min。孵育结束后，弃去孔内液体，每孔加入300μL洗涤液，摄荡洗涤5次，每次5min。于吸水滤纸上拍干除去孔内残余液体。9.6. 4加酶标抗体用血清稀释液1：4000稀释山羊抗貂IgG/HRP，100μL/孔，37C温箱孵育30min，洗板同9.6.3，每次拍干，9.6.5显色每孔加人100μL底物显色液，轻轻摇勾，25C避光显色10min，9.6.6终止反应每孔加人100μL终止液终止反应。9. 6.7读数用酶标仪读取ODm值。9.7质控标准计算阳性对照ODm平均值和阴性对照ODaom平均值。阳性对照两孔平均OD450m值≥1.0，阴性对照两孔平均ODs%rm值0.2时，判定实验成立，否则实验不成立。9.8结果判定9.8.1计算待测样品S/P值：S/P=(ODs样品平均值一ODsm阴性对照平均值)/(ODsem阳性对照平均值一ODsm阴性对照平均值），若S/P0.23，判定为AMDV抗体阳性。9.8.2S/P0.23时,判定为AMDV抗体阴性。10综合判定10.1符合临床症状、病理变化可判为疑似病例，取样经PCR检测或实时定量PCR检测为阳性，可诊断为水貂阿留申病。10. 22符合临床症状、病理变化可判为聚似病例，取样经CIEP或ELISA检测为阳性，可诊断为水貂阿留申病。 NY/T 4041—2021附录A(资料性)AMIDVPCR检测引物、溶液的配制、电泳示意图及扩增产物序列A. 1PCR扩增引物序列正向引物(374F);5-CATATTCACTGTTGCTTAGGTTA-3’;反向引物(374R);5-CGTTCTTTGTTAGTTAGGTTGTC-3’;扩增片段长度；374bp。A2PCR溶液的配制A.2.11XTAE电泳缓冲液A.2.1. 150 ×TAE 储存液三羟甲基氮基甲烷(Tris)242 g乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA·2H,O)37. 2 g冰乙酸57. 1 mL灭菌蒸馅水800 mL充分规拌落解，加灭围蒸幅水定容至1L，室温保存。A. 2. 1. 221×TAE工作液50XTAE储存液10 mL灭菌蒸馏水490 mL充分搅拌溶解，室温保存。A.2.21%琼脂糖凝胶琼脂糖1 g1XTAE溶液100 mL充分混勾后，置于微波炉中温加热至凝胶完全溶化成液体，A. 3PCR电泳示意图见图A.1。 NY/T 404120212 000 bp1.000 hp750 bp500 bp250 bp100 bp标引序号说明：M—DL2000 DNA Marker; 阳性样品：阳性对照;明性对照，图A.1PCR扩增结果示意图A.4AMDVPCR扩增产物序列374bp(ADMV-G株，GenBank登录号M20036)5-CATATTCACTGTTGCTTAGGTTACTTTGATAAGAATGAAGATCCTAAGGATGTTCAAAAATCCTTAGGTTGGTTTATGAAAAGACTAAATAAAGACCTAGCAGTTATCT