聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.pptxVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质; 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8，AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 ;; 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。 ;不连续体系由凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、pH因素所组成。浓缩胶是大孔径，分离胶是小孔径；Cl-为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、Tris为缓冲配对离子,Cl-PrGly-;浓缩胶缓冲液为pH6.7 ，分离胶缓冲液为pH8.9 ；电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液; 电位梯度的差异是自动形成的，在快离子与慢离子之间形成电位梯度，由于Pr的有效迁移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成狭小的中间层；2种孔径的凝胶、3种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了，样品得到浓缩。; 样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子或慢离子：甘氨酸根 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： ;第7页/共28页;分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。;实验仪器; 刻度吸量管; 培养皿; 脱色摇床;实验试剂; TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。 过硫酸铵(不能潮解，否则不能用) 染色液：用0.05N NaOH配制0.1％溴酚兰液 洗脱液：7％醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。;贮存液;实验步骤;试剂; 3. 灌柱 ⑴按上述操作，把分离胶溶液混匀，用滴管将分离胶溶液加入到电泳管中，高至7cm处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入0.5cm高的水层，切勿打乱凝胶液面，静置30min左右。 ⑵待分离胶成胶后，用细滤纸条??干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再小心沿管壁加DDW高约0.5cm，静置15min左右。 ⑶该浓缩胶成胶后，弃去上层水分，拔出橡胶帽。; 4、样品液制备： 血清:0.1ml 40%蔗糖:0.1ml 于一0.5mlEP管中混匀备用 0.05%溴酚兰:0.1ml ; ; 7、电泳： 上槽——负极 下槽——正极 电流：先浓缩胶:1.5mA/管 然后分离胶:3.0mA/管; 8、剥胶 电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器(针头长约6～8厘米)，吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。;9、 固定和染色： 先用固定液固定5分钟，再在培养皿中装染色液，摇床染色10min。 ;第24页/共28页;实验结果; 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂， 对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。 注意观察实验现象：分界面，浓缩效应。 溴酚兰染色﹑脱色﹑染液回收。 固体胶切忌倒入水池。;思考题;感谢观看！