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生物化学实验二第1页/共43页第2页/共43页 生物化学实验技术理论第3页/共43页一、层析技术1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。第4页/共43页一、层析技术1、层析技术原理2、层析技术分类3、常用层析技术原理第5页/共43页 1、层析技术原理层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第6页/共43页2、层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析 凝胶过滤固体液体分子大小第7页/共43页3、常用的层析原理（1）分配层析——纸层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。 固定相内溶质的浓度 α= 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）第8页/共43页64 212832 416 8641264322048323048484032401640 30 20 12 8 4 2第9页/共43页纸层析纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。第10页/共43页（2）离子交换层析原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+ 阴离子：Cl-、OH-第11页/共43页示意图（交换树脂表面）第12页/共43页示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子第13页/共43页B物质A物质示意图水分子第14页/共43页（3）吸附层析原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。第15页/共43页吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子第16页/共43页（4）亲和层析原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。第17页/共43页第18页/共43页（5）凝胶过滤原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。第19页/共43页第20页/共43页电 泳 技 术一.电泳的概念二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理四.几种常见电泳方法的比较五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理第21页/共43页 一.电泳的概念 带电质点在电场中移动的现象。第22页/共43页二.电泳技术分类第23页/共43页三.电泳技术基本原理 1.基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动; pH pI分子带正电荷,在电场中向负极移动; 泳动度u=v=d/t=dleV/lVt第24页/共43页 2.影响电泳速度的因素(1) 电场强度泳动速度与电场强度成正比常压电泳(