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第1页/共23页sd大鼠骨髓间充质干细胞体外分离第2页/共23页实验结果：大鼠BMSCs体外培养生长状况良好，可见BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式细胞仪检测显示BMSCs表达CD29、CD90，不表达CD34、CD45。经体外诱导后具有多向分化潜能。第3页/共23页试验方法：全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs，体外培养和连续传代，在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定其生长曲线，流式细胞仪鉴定其表面抗原，成骨、成脂肪诱导分化鉴定其多向分化潜能。第4页/共23页结论：全骨髓贴壁培养法适合体外分离、扩增和纯化大鼠BMSCs，培养的大鼠BMSCs具有间充质干细胞的一般生物学特性，为后续基因修饰BMSCs及其体内移植实验奠定良好的基础。第5页/共23页实验材料：6~8 周龄雄性SD大鼠，体质量80~100 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号为SC-XK(沪)20082-005]。胎牛血清(美国Hyclone 公司)，L-DMEM 培养基(美国Gibco公司)，胰酶( 美国Gibco 公司)，CD34-FITC 抗体、CD45-FITC 抗体、CD90-FITC 抗体(英国AbD Serotec公司)，CD29-FITC抗体(美国Biolegend公司)第6页/共23页前言：骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作为一种组织特异性干细胞，具有高度增殖能力和多向分化潜能，其作为种子细胞在干细胞移植和基因治疗等方面的研究倍受关注。2007年9月至2008年8月我们开展了体外分离纯化及培养扩增大鼠BMSCs 的实验，为进行基因修饰BMSCs及其体内移植的后续实验奠定良好的基础。第7页/共23页试验方法：1、鼠原代BMSCs的分离培养抽取10%水合氯醛0.2 ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠双下肢5min，无菌条件下分离出大鼠双侧的股骨和胫骨，将离体的骨干放入灭菌PBS缓冲液中冲洗后转入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基的培养皿中。剪去两侧干骺端，暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔内所有骨髓液冲净。反复吹打骨髓冲洗液制成单细胞悬液，将此悬液接种于25cm2的塑料培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱内培养。3d后首次换液，以后每3d换液1次。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。第8页/共23页2、大鼠BMSCs的传代与纯化通过全骨髓贴壁培养法，每次换液弃除悬浮细胞。贴壁细胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴细胞、单核细胞等造血细胞，7~10d原代细胞生长融合达80%~90%，以0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按1:2的比例传代培养。原代细胞传代后的细胞标记为P1 (Passage 1)，反复传代扩增，并依次递增标记。每次传代时用0.25% EDTA-胰蛋白酶(0.04 ml/cm2)消化1~2 min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基终止消化。严格控制胰酶的用量和消化时间，利用BMSCs较易脱落的特点，保证BMSCs在较短的时间内与培养瓶底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使BMSCs得到纯化。第9页/共23页大鼠BMSCs生长曲线测定：为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml。接种于96孔板，每孔接种200 μl 细胞悬液进行培养(每孔1×104细胞)。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液(5 mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min，使结晶充分溶解。与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度(A)值，连续测7d，以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。第10页/共23页2、大鼠BMSCs P4细胞成骨、成脂诱导分化鉴定(1)向成骨细胞诱导分化：待培养的BMSCs P3细胞生长至80%~90%的融合，加入0.25%EDTA-胰酶消化后，以2×104/孔的密度接种于6孔培养板，常规培养1d后，诱导分化培养组(实验组)加入2 ml成骨诱导分化培养液，基础培养组(对照组)加入等量基础培养液，每3d换液1次。成骨诱导21d后，进行茜素红染色检测，确定细胞外基质的矿化。(2)茜素红染色：两组细胞分别用PBS冲洗2次，95%乙醇固定5 min，茜素红染液染色5 min，蒸馏水冲洗3 次，倒置相差显微镜下观察细胞的形