蛋白质研究技术.pptxVIP

蛋白质研究技术;一、蛋白质的理化性质;蛋白质分子颗粒大小1~100nm之间,属胶体颗粒范围; 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀; 蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀;(1) 盐析法( salting out);(2) 有机溶剂沉淀法 ;(3) 重金属盐沉淀法 ;(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 ;(二) 蛋白质的凝固;超滤：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通 过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在 膜上，称为超过滤;透析工作图;超滤工作图;(四) 电 泳?;(四) 电 泳?;;(四) 电 泳?;;(四) 电 泳?;等电聚焦;(五) 层 析;离子交换色谱;实验条件的选择;实验条件的选择;疏水作用色谱; 疏水作用色谱的洗脱一般采用降低缓冲液中的盐浓度来 洗脱蛋白 也可以采用加入少量的有机溶剂来洗脱，如反相色谱;凝胶过滤色谱;凝胶过滤色谱的洗脱;凝胶过滤色谱的应用;亲和色谱;;亲和色谱的洗脱;亲和色谱的应用;金属螯合色谱;特点： 体系复杂: 含量低、组分多、干扰大 水溶液体系： 接近生理状态，尽量避免 使用有机溶剂 低温操作： 防止蛋白变性和失活 必要的添加剂： 蛋白酶抑制剂、还原剂 专业的仪器设备：制备型 ;蛋白质分离、纯化和鉴定;蛋白质分离纯化方法;蛋白质分离纯化方法;蛋白分离纯化的目的; 从有机体中获得纯的蛋白要尽可能的用较少 的步骤，尽可能少的丢失活力; 细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然的 状态) — 折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白） — 可通过差速离心分离细胞组份 — 纯化可用色谱方法（chromatography）; cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白易形成包涵体（inclusion body）） — 重组蛋白基因在大肠杆菌、昆虫细胞、 哺 乳动物细胞或植物细胞中表达 — 也用差速离心及色谱方法纯化 — 在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化;破碎细胞;;影响组织提取的因素;组织破碎(Tissue disruption);细胞破碎(Cell Disruption);初步纯化 -- 热变性;初步纯化 -- 沉淀;蛋白质粗分离 II：表达蛋白;菌体;蛋白质的精细纯化 ;蛋白质的鉴定;SDS测定蛋??质的分子量和纯度 ;MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度 ;蛋白质的鉴定;;感谢您的欣赏