酶联免疫吸附分析.pptxVIP

第1页/共37页酶联免疫吸附分析第2页/共37页抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性第3页/共37页抗原-抗体识别反应示意图第4页/共37页一、ELISA原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）第5页/共37页ELISA原理 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。第6页/共37页YYELISA原理 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 方法简单，方便迅速，特异性强。第7页/共37页ELISA原理酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应。第8页/共37页酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420 β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420 第9页/共37页ELISA的种类和变化 （一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA 第10页/共37页（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原第11页/共37页获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体 加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤除去未结合的抗体及杂质 加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物 洗涤并除去未结合的封闭蛋白加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物 洗涤除去其他未结合的物质 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定彻底洗涤未结合的 酶标抗体 加底物进行酶催化反应 第12页/共37页（二）间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。第13页/共37页加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质 包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体 加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体 加底物显色 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定第14页/共37页ELISA法间接法测定抗体1.原理第15页/共37页（三）竞争法 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。 第16页/共37页测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合 用已知特异性抗体包被固相载体 对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合 分别洗涤除去未结合的成分 加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量第17页/共37页ELISA特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 。 第18页/共37