基因过表达小RNA干扰基因检测.pptxVIP

基因过表达小RNA干扰基因检测;表达基因 表达ORF ;组织特异性表达的目的基因： 需分离、克隆组织特异性启动子 应用：胰腺癌特异性启动子基因工程 理想情况：胰腺癌中表达较高，但正常细胞中不表达或表达很低， 将促凋亡基因至于其下游，可望实现基因治疗。; 在保留组织特异性表达 的基础上，进行基因工程 改造，以增强启动子强度 为目标。;Xie X et al. Cancer Cell 2007, 12 (1): 52-65.;大多数基因的过表达不涉及组织特异性表达;目的基因与载体的连接 连接策略： 1. 粘性末端连接 （如EcoRI 或 HindIII） 2.定向克隆 （如EcoRI + HindIII） 3. 平末端连接 （EcoRV， 或Klenow） 4. 加人工接头连接 5. T-A 克隆（T-A cloning ） 注意： 载体是有方向的，而目的片段可以双向与之相连。 如果以表达为目的，我们要对插入片段进行方向鉴定。 一般构建表达载体都选择定向克隆。;转化细菌 ：将质粒导入受体菌;不同细胞，质粒进入的效率区别较大。 如果目的细胞用质粒很好转染，那就用质粒就可以了，可以少很多实验费用。如果目的细胞不好转，才要用病毒来感染。决定用质粒还是腺病毒的最主要因素，不是表达效率，而是进入细胞的效率。 推荐用慢病毒载体介导的基因过表达，转染效率高，并且可以稳定表达，通常对宿主细胞没有毒性。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基. 础发展起来的基因治疗载体。?区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。;（抗性基因）;第11页/共35页;目前许多生物公司可提供相关服务。;基因表达的整个过程：DNA经转录（transcription）合成信使RNA （mRNA）， 再以mRNA 为模板翻译（translation）成蛋白质。 在原核细胞和真核细胞之间，转录的起始与终止、翻译的起始调节因子， 以及翻译后的加工过程都是显著不同的。任何一个环节不能正确地进行，均 可导致基因表达失败。 基因表达产物的检测： mRNA RT-PCR （略） , real-time qPCR 2. 蛋白质 Western 印迹法， 荧光显微镜检测 （略） ;?Western blot 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺 凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜， 或 PVDF转移膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离 的多肽类型及其生物学活性不变。;实时荧光定量 PCR ： 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现 对起始模板定量及定性的分析。最常用TaqMan 荧光探针，它是一种寡核苷 酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关，设计为与目的基因上游引物和 下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在TaqMan探针的 5’末端，而淬灭 剂则在 3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因 与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶 活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增 加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正 比关系。;举例：ABI 7500 PCR仪; 阈值必须设在线性期中。当模板量减少时，CT值随之增加。 反应混合物或仪器中的任何改变，只要能影响与CT值计算 相关的荧光测定，都会使CT值产生非模板依赖性的变化。因此， 在不同条件下或用不同试剂进行的PCR反应产生的CT值不可以直 接进行比较。 各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 。;判断扩增曲线是否良好的指标： 曲线拐点清楚，指数期明显； 扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象； 指数期斜率越大，扩增效率越高 （成正比）； 各反应管扩增效率相近，各管的扩增曲线平行性好 ;荧光定