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1高效液相色谱第1页/共71页 以液体作为流动相的色谱过程HPLC定义第2页/共71页 高效液相色谱法的特点高压 --- 150 ~ 350 x 105 Pa高效 --- 3万塔板/米高灵敏度 --- 10-9~ 10-11 g 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法第3页/共71页 ?GCHPLC流动相惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物不同极性的液体（有一定亲和作用）温 度 较 高一般室温分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物GC与HPLC比较第4页/共71页 （一）分配色谱 （二）吸附色谱（三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法高效液相色谱法的类型第5页/共71页 分配色谱液液分配色谱(LLPC)键合固定相分配色谱(LSPC) 分配色谱法(Partition Chromatography)液体固定相通过物理吸附固定于载体表面有机分子通过化学反应键合到载体表面第6页/共71页 分配色谱–分离原理不同组分在两相间分配系数不同第7页/共71页 固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）全多孔型担体薄壳型微珠担体分配色谱固定相固定相 --- 化学键合R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团第8页/共71页 固定相的化学构造非键合相表面键合相表面ODC C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN第9页/共71页 正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane)第10页/共71页 正相分配色谱反相分配色谱固定相性质极性非极性键合基团 极性基团疏水基团流动相性质非极性极性出峰顺序 极性小先出 极性大先出第11页/共71页 吸附色谱法分离原理溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争第12页/共71页 吸附色谱固定相 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。第13页/共71页 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 分离原理固定相分离对象离子或可离解的化合物（无机离子、氨基酸、蛋白质等）第14页/共71页 分离原理根据样品分子尺寸大小分离 大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。排阻色谱法(凝胶色谱法)第15页/共71页 1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色 谱） 排阻色谱固定相第16页/共71页 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。应用第17页/共71页 流动液贮存提供脱气输液泵进样系统分离系统检测系统控制与记录系统 高效液相色谱仪第18页/共71页 日本岛津公司第19页/共71页 美国Waters公司第20页/共71页 （1）真空泵抽滤系统（2）低溶性惰性气体导入替换（3）超声脱气（4）在线脱气流动相脱气方法第21页/共71页 输液系统高压输液泵：高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 活塞泵 注射泵 气动泵第22页/共71页 进样系统 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀第23页/共71页 色谱柱色谱柱泵泵12进样 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀进样系统第24页/共71页 色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 第25页/共71页 检测器 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器第26页/共71页 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，31