标记有丝分裂百分率法计算.docx

细 胞 周 期 测 定 ----标记有丝分裂百分率法 标记有丝分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间 的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通 过统计标记有丝分裂分裂期细胞百分数的办法来测定细胞周期。 细胞周期测定，首先待测定的细胞进行同步化。在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中，需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。 细胞人工同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法；诱导同步化常用的方法有 DNA 合成阻断法和中期阻断法。下面简单介绍有丝分裂选择法与 DNA 合成阻断法。 选择同步化主要是有丝分裂选择法，该法利用 M 期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使 M 期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放 4℃冰箱中保存，离心沉淀后即获得 M 期细胞。 DNA 合成阻断法，选用 DNA 合成抑制剂可逆地抑制 S 期细胞 DNA 合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在 G1/S 期交界处；胸腺嘧啶核苷（TDR）双阻断法为最常用的方法：该法利用过量 TDR 能阻碍 DNA 合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次 TDR 阻断法，即双阻断法。第 1 次阻断时间相当于 G2、M 和 G1 期时间的总和或稍长， 释放时间不短于 S 期时间，而小于 G2+M+G1 期时间，这样才能使所有位于 G1/S 期的细胞通过S 期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个 S 期。第 2 次阻断时间同第 1 次，再释放。 现以 HeLa 细胞为例加以说明（HeLa 细胞周期时间为 21h，其中 G1 期为 10h，S 期为 7h， G2 期为 3h，M 期为 1h）。 首先将细胞培养至指数生长期的早期，加入含 2mmol/LTDR 的培养基（2－2.5mmol/L 用于肿瘤细胞的同步化培养），作用 16h。弃掉 TDR 培养基，用 Hanks 液洗 2－3 次，再换上新鲜培养基继续温浴 9h。重新加入 TDR 培养基（浓度同上）进行第 2 次阻断，作用 16h。再弃掉 TDR 培养基，Hanks 液洗 2－3 次后换上普通培养基。第 2 次 TDR 释放 0h 时取样则细胞处于 G1/S 期交界处；如 2－7h 取样则为不同阶段的 S 期细胞。 注意：具体 TDR 作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。 标记有丝分裂分裂期细胞百分数的办法来测定细胞周期，首先取同步化了的不同阶段的 S 期细胞，利用 3H 标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TDR）短暂培养该种细胞一段时间后，处于 S 期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸腺嘧啶脱氧核苷，再移至普通培养基中培养，换用无 放射性的新鲜培养液培养，定期检测。不同间隔时间取样，找出正处于分裂期细胞的百分数。 测定原理： T ：G1 期的持续时间 G1 细胞周期各阶段的时间与 PLM 的关系 G2T ：G2 期的持续时间 G2 ①待测细胞经 3H-TDR 标记后，所有 S 期细胞均被标记。 S②S 期细胞经 G2 期才进入 M 期，所以一段时间内 PLM=0。 S  T ：S 期的持续时间 T ：M 期的持续时间 M ③开始出现标记 M 期细胞时，表示最早处于 S 期最后阶段的细胞（即领先细胞），已渡过 G2 期，所以从 PLM=0 到出现 PLM 的时间间隔为 TG2。 ④S 期细胞逐渐进入 M 期，PLM 上升，到达到最高点的时候说明来自处于 S 最后阶段的细胞，已完成M，进入G1 期。所以从放射性开始出现 M 到 PLM 达到最高点（≈100%）的时间间隔就是 TM。 ⑤当 PLM 开始下降时，表明最晚处于 S 期最初阶段的细胞（即落后细胞）也已进入 M 期， 所以放射性出现 PLM 到 PLM 又开始下降的一段时间等于 TS。 G1 S G2 M⑥从 PLM 出现到下一次 PLM 出现的时间间隔就等于 TC，根据 TC=T +T +T +T 即可求出的 TG1 G1 S G2 M 事实上由于一个细胞群体中 TC 和各时相不尽相同，第一个峰常达不到 100%，以后的峰会发生衰减，PLM 不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2 的方式求出 TM。 例 1：为测定某种细胞分裂的细胞周期，利用 3H 标记的胸腺嘧啶脱氧核苷短暂培养该种细胞一段时间后，处于 S 期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸腺嘧啶脱氧核苷，再移至普通培养基中培