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生物化学检测技术;第一章 生物化学检测技术;内容;目标;第一节 电泳检测技术;电泳槽和大分子分离结果;电泳技术分类;从实际和实用出发的分类;自由电泳 可分为：① 显微电泳（也称细胞电泳），是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；② 移界电泳；③ 柱电泳；④ 自由流动幕电泳；⑤ 等速电泳等。 支持物电泳 根据支持物的特点又可分为： 纸电泳 薄层电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 非凝胶性支持物区带电泳 (支持物有：淀 粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶等) 凝胶区带电泳：淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰 胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳。;2023/3/14;2023/3/14;电泳基本原理;带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。 电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有： v = F阻/f = FE/f = E·q/f = E·q/(6π·r·η) v — 泳动度 F阻 — 颗粒所受阻力 FE — 颗粒所受电场力 f — 摩擦系数 由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动度与粒子形状有关。;相对迁移率（Rf）： 分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。 测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置（前沿）作一标记（通常是插一根短铜丝），染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。 Rf＝ 谱带迁移距离/ 前沿指示剂迁移距离 测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。 另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。;一、琼脂糖凝胶电泳;以对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶的特点： 天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列织成。;2、操作方法 试剂与??备 ;制胶： 称干粉，融化，倒胶，插梳子，凝固，装电泳槽。;3、步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。） ⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 ;⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 ;目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，琼脂糖是经过挑选，以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。 优点如下： 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。;目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合 ，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验 方法之一。;;2023/3/14;2023/3/14;2023/3/14;4、影响因素 1）琼脂糖 来源，纯度。酸根取代导致Agarose带电。 对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂于聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。 2）胶浓度 ; 3） 电场