固定化酶与固定化细胞技术.pptxVIP

固定化酶与固定化细胞技术;2. 酶在应用中受到的限制因素：;（1）人工合成酶：应用化学合成法合成具有像酶那样活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的必威体育精装版技术。但距实际应用还有很大距离。 （2）酶的人工“改性”、“修饰”：酶和细胞固定化是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。 ;难得的报道：人工合成脂肪酶获得成功  随着生物产业的发展，人类对环境逐步认识，酶的广泛用途越来越得到人类的重视，尤其脂肪酶，在日化洗涤剂领域、医药美容领域、能源领域生物柴油生产中显得无可替代的优势。一般脂肪酶生产主要来源于发酵微生物生产法获得，产量受到限制，成本较高，很难满足工业需求。关于人工合成脂肪酶在中国乃至世界未曾有过相关报道。 经过不懈努力，我公司通过人工合成的手段获得成功，实属国际首例。经检验它不仅具备生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、环境要求、毒化耐性各项指标远远高于普通生物酶。生产成本不足普通酶的三分之一，而且不受产量的局限，可大规模投入生产。  石家庄市华北联化科技有限公司 ;第一节 固定化酶 （Immobilized Enzyme） ;二、制备固定化酶的原则 ;三、固定化酶的制备方法;（1）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。 高岭土：胰凝乳蛋白酶 皂土： 过氧化氢酶、核糖核酸酶 氧化铝：葡萄糖氧化酶 二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。 不锈钢：直径100-200粒子，以氧化钛处理，可吸附β-半乳糖苷酶（17mg/g载体）。;9;10;（2）有机吸附载体 纤维素粉：糖苷水解酶 火棉胶：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（70mg酶蛋白/ cm2） ) ; 火棉胶： 硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的树脂与之相结合,通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。 ? ?对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人体，影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧??炸。长期贮存能自燃。;2、影响因素;3、吸附法优缺点;4、方法举例;①酶的发酵生产 Aspergillus oryzae 3042扩大曲——40-50小时发酵——6倍冷蒸馏水抽提2次——压滤——酶液（亮黄色）测活力。（25μM/小时/ml） ②载体予处理：DEAE-sephadex 25溶胀——0.05mol/L NaOH处理——洗涤。 ③固定化：酶液调节pH7.0-7.0——与载体混合（载体湿重：酶液=1g：60ml）——4-7℃冷库搅拌吸附过夜——吸去上清液——用蒸馏水和0.15Mol/L醋酸钠水溶液洗涤——水洗涤后4℃备用。;（二）共价结合法;在进行一种酶的固定时，首先要考虑酶的氨基酸组成、活性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性和影响。实际上，共价偶联中最普遍使用的基团是：氨基、羧基、和苯环。 共价偶联反应应注意的问题： (1) 共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。 (2) 反应尽可能温和 (3) 最好能在水溶液中进行 (4) 较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很高的专一性，而对其它基团或才水溶液几乎无副反应。;载体选择时的注意问题： (1) 理化性质：应是亲水性质的，疏水载体往往对酶有变性的作用。 (2) 有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。 (3) 机械强度和稳定性 (4) 具备在温和条件下与酶结合的功能团。;第20页/共83页;按载体连接的基团类型分为： (1) 苯氨基载体 (2) 羧基载体 (3) 酯族氨基载体 (4) 硅烷化无机载体;1、重氮法;;重氮法常用的载体有： 带苯氨基的珠状聚丙烯酰胺 带苯氨基的多孔玻璃 间氨基苯甲氧基纤维素 对氨基苯纤维素。 ;例：ABSE-纤维素固定化胰蛋白酶 ;（4）偶联酶： A. 配制酶液: 20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05M CaCl2-0.03ml正丁胺(保护剂)混合液(预先以1M HCl调至pH9.5)； B. ABSE-纤维素处理：取5gABSE-纤维素，加10ml蒸馏水，冰水浴，边搅拌边加1M HCl、5%NaNO2各2.5ml，摇匀，冰浴15min抽滤，取出滤饼，迅速用预冷的0.05M HCl和蒸馏水各洗涤三次。(重氮化) C. 偶联：滤饼投入胰蛋白酶液中，立即用2M Tris液调pH至7.5-7.8，搅拌1h，抽滤。 D. 洗涤：固定化酶以50ml 3%NaCl搅拌洗涤3次，水洗涤2次后，悬浮于0.05M CaCl