分子生物学与基因工程课件-DNA提取和制备.pptxVIP

核酸的分离纯化; 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。;　DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。;一、提取DNA总的原则：;没有严格要求: PCR Southern Blots RFLP;没有严格要求 常规PCR;二、样本来源：;血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上 ;DNA提取前样本采集、预处理和保存：;mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）;（二）血浆和血清;血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物 它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景 血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分;血浆DNA;（三）体液;（四）分泌物;结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液 痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率;三、基因组提取方法;四、DNA的收率;五、DNA提取的基本步骤;各种组织细胞破碎方法;破裂细胞 、释放核酸;2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液;3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤;基因组提取流程;4、DNA鉴定;浓度鉴定;2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）;EB与DNA的结合 ;500?l全血提取的基因组DNA电泳;★ 纯度（ OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）OD260-320 /OD280-320 1.7 说明有蛋白的污染OD260-320 /OD280-320＝1.7～1.9 说明纯度很好OD260-320 /OD280-320 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 ★ A260/A280比值是纯度检测的重要指标。 ;完整性鉴定;5、核酸的贮存——DNA保存 ;基因组DNA的分离与纯化;一、DNA提取;DNA酚抽提法示意图;主要试剂的作用： EDTA：1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2.降低细胞膜的稳定性;SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性;蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用;苯酚的特点： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA;PH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 ;DNA的沉淀;（二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。;（三） 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb;DNA玻棒缠绕法示意图;（四） 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。;二