发酵——基因工程菌.pptxVIP

第1页/共67页发酵——基因工程菌第2页/共67页细胞因子、疫苗、酶第3页/共67页二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单 如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞第4页/共67页1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。第5页/共67页大肠杆菌作为宿主的主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是不折叠的，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增加蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质N端常多一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。第6页/共67页真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。第7页/共67页2、G+细菌 枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖基化缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差其他: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。第8页/共67页3、低等真核细胞酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25%个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。不产内毒素有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。第9页/共67页丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。 影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。第10页/共67页4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转译后处理（修饰）与在整个动物中相同，在某种情况下可能转译后修饰有些不同，但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。第11页/共67页 三类主要基因工程表达体系的比较表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内部分可高产对原核好 不大 融合蛋白 酵 母 多肽、蛋白 菌内可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然动物细胞 完整 胞外 几乎可为可能有 糖基化蛋白可高产 天然产物致癌因素第12页/共67页三、利用基因工程菌生产的特点（一）基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。（二）基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。第13页/共67页（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失结构不稳定性宿主细胞调节突变 第14页/共67页1、分离丢失 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。为