荧光定量PCR基础原理.pptxVIP

会计学第1页/共39页○PCR扩增的理论模式○Real time PCR理论基础第2页/共39页PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。第3页/共39页由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。第4页/共39页实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。第5页/共39页PCR扩增的理论模式 PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。PCR 理论方程：N = N0 × (1+E)nN: 扩增子数量N0: 起始模板数量E：扩增效率n:循环数此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。第6页/共39页PCR分期——“S”形曲线对 PCR 扩增过程的详细分析表明，PCR 扩增曲线可被分为三个典型时期：早期背景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增期），以及晚期的平台期第7页/共39页理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线；因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。第8页/共39页两种定量方法第9页/共39页第10页/共39页两种定量方法终点定量起点定量无规律对数期分析：平行性好终点产物数量：误差大拐点产物数量：重现性好，误差小影响因素多扩增效率恒定，标准曲线呈线性起始DNA量，更具意义重现性好，误差小扩增效率恒定，标准曲线呈线性第11页/共39页普通PCR技术的检测模式普通PCR仪器扩增，约2.5小时无法定量阴性样品检测结果琼脂糖凝胶电泳，约1小时阳性EB染色，约20分钟紫外成像第12页/共39页实时荧光定量PCR的检测模式荧光定量PCR仪器扩增，约2小时光滑的S型指数曲线，阳性检测过程有实时监测数据无S型指数曲线，阴性第13页/共39页实时荧光定量PCR的检测模式四个已知浓度的标准品，得到标准曲线需绝对定量时系统即可自动计算出未知样品的浓度第14页/共39页阴性结果曲线图示第15页/共39页阳性结果曲线图示第16页/共39页实时荧光定量PCR基本原理在常规PCR反应的基础上，加入荧光染料或荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR产物不段累积，荧光信号强度等比增强。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而对起始模板定量及定性的分析。第17页/共39页荧光扩增曲线分三阶段荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期荧光背景信号阶段：该时期扩增的荧光信号被背景信号所掩盖，扩增产物量无法判断。平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系，因此选择这一阶段进行定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。第18页/共39页实时定量PCR的两个重要概念（1）荧光域值（?threshold）：荧光扩增曲线上人为设定一个值，以PCR反应的前15?个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10?倍。阈值 = 基线信号的标准偏差 x 10第19页/共39页实时定量PCR的两个重要概念(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，Ct值也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的循环次数,可见Ct值取决于阈值。 第20页/共39页基线 阈值Ct值第21页/共39页Ct值∝DNA起始浓度Ct值与模板DNA的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，达到荧光阈值的Ct值越小。Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度R