基因诊断与基因治疗.ppt

目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。 逆转录病毒（retrovirus） 第三十页，共四十八页。 第三十一页，共四十八页。 第三十二页，共四十八页。 第三十三页，共四十八页。 第三十四页，共四十八页。 目 录 目 录 第 二 十 一 章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 第一页，共四十八页。 基因变异致病类型 内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。 外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。 第二页，共四十八页。 第一节 基因诊断Gene Diagnosis 第三页，共四十八页。 一、基因诊断的概念、内容和特点 定义: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 前提条件： 已明确疾病表型与基因型的关系。 第四页，共四十八页。 基因诊断的基本内容 检测个体基因序列特征 基因突变分析 测定基因拷贝数 基因表达产物分析 测定是否存在外源基因 第五页，共四十八页。 特点: 1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊 断”，针对性强。 2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。 3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。 4.适用性强，诊断范围广。 5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。 第六页，共四十八页。 基因变异致病类型 内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。 外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。 第七页，共四十八页。 二、基因诊断常用技术方法 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO) （一）核酸分子杂交技术 第八页，共四十八页。 × MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 第九页，共四十八页。 + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 第十页，共四十八页。 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异，中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不的片段，称为限制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。 DNA限制性片段长度多态性（RFLP） 第十一页，共四十八页。 RLFP分析法 第十二页，共四十八页。 第十三页，共四十八页。 （二）聚合酶链反应 (PCR) PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。 第十四页，共四十八页。 正常人 纯合突变 杂合突变 Leber 病患者 PCR/SSCP分析 + ﹣ 第十五页，共四十八页。 PCR/等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide， ASO) 第十六页，共四十八页。 （三）基因测序 即测定DNA序列的技术。分离患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的基因检测方法。 目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert发明的化学降解法