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抑制性扣除杂交（SSH）-DNA实验基础 如果两处理间存在较大差异，以及某些基因在Tester中存在上调表达（up-regulated expression）时，用RAD方法则达不到预期目的。于是，Diatchenko. L等于1996年提出了一种可以有效克服基因上调表达所造成不利后果的克隆基因的新方法——抑制性扣除杂交（SSH）。该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA。从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而所谓抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。其具体过程第一步与RAD相同，酶切后得到Tester与Driver样本的平末端cDNA片段。1.将Tester cDNA均分两份，分别接上接头1 (adaptor 1)和接头2 (adaptor 2)。接头设计上，adaptor由一长链(40nt)和一短链(10nt)组成的一端是平端的双链DNA片段，长链3′端与cDNA5′端相连。长链外侧序列(约20nt)与第一次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第二次引物序列同。此外，接头上含有Ｔ7启动子序列及内切酶识别位点，为以后连接克隆载体和测序提供方便；2.用过量的Driver样品分别与两份Tester样品进行第一次扣除杂交，分别得到4种产物。这种不充分杂交使得单链ｃＤＮＡ分子在浓度上基本相同。同时由于Tester cDNA中与Driver cDNA序列相同片段大都形成异源双链分子ｃ，使得Tester cDNA中差异表达基因得到第一次富集；3.混合两份杂交样品，同时加入新的变性Driver cDNA进行第二次扣除杂交。此次杂交只有第一次杂交后经扣除和丰度均等化的单链Tester cDNA能与Driver cDNA形成双链分子。这一次杂交进一步富集了差异表达的cDNA，并且还形成了两个5′端分别接不同接头的双链分子ｅ；5′填平末端，加入根据接头长链序列设计的内、外侧引物进行PCR扩增。第一次PCR是基于其抑制效应，只有两端分别是接头1和接头2的具差别表达的序列片段得以指数扩增。第二次PCR 极大提高扩增的特异性，使得差异表达的目的基因片段得到大量富集，并可用于后续的筛选工作。SSH自从在克隆基因的实验中采用以来,其优势是非常明显的,主要表现在:1)极大降低了假阳性率,由于SSH方法采用两次扣除杂交和两次 PCR,保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%;2)具高度灵敏性,由于在反应中将丰度不同的单链分子含量归一化,保证了低丰度mRNA检测成功;3) SSH法在一次反应中,可同时分离出上百个差异表达的基因,这一点远胜于DDRT-PCR和RAD。而其缺点与RAD类似。