hplc测定发酵液中氨基酸的含量资料.pdfVIP

学习资料 HPLC测定发酵液中氨基酸的含量 一、主要试剂及配置方法 衍生试剂溶液：0.5％ 2,4－二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液 衍生缓冲溶液的配制：称取衍生缓冲溶液固体组分（NaHCO ）4.2g加入至 100mL3 容量瓶中，定容并摇匀后备用。 定容缓冲溶液的配制：称取定容缓冲溶液固体组分（磷酸二氢钾）3.4g，加入至 500mL容量瓶中，加入0.1mol/LNaOH145.5mL定容。 流动相A 的配制：乙腈－水（1：1）：相同体积的乙腈与水混合，超声波脱气 10-15min。 流动相B 的配制：流动相B 固体成分（NaAc）8.2g加水至2000mL，超声波脱 气10-15min。 氨基酸标样：每种色谱纯氨基酸标品秤取0.5g，用水溶解后，定容至100mL， 配成5g/L的氨基酸标准溶液。 发酵液预处理：用可调微量移液器吸取1.0mL发酵液于1.5mL小离心管中，高 速离心（10000r/min，2min）沉淀菌体等固形物。 二、衍生方法 准确量取发酵液原液2微升，加入装有0.2mL衍生缓冲溶液的5mL塑料离 心管中，然后加入0.1mL衍生试剂溶液，摇匀，注意不要漏液，将塑料离心管 置于60℃水浴中暗处恒温加热60min后取出，注意不要让水进入离心管，放置 待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液0.7mL并摇匀，放置15min后可以开始进 行色谱分离。 三、色谱分离条件 色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS柱或C18柱；检测系统为：紫外 检测器，柱温：33℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表所示；波长360nm检 测；流动相总流量为1mL/min。 流动相梯度时间表 序号 流量/ 时间 流动相A 流动相B 线性设定 备注 /min mL/min /% /% 1 1 0 16 84 Line 初始状态 2 1 0.3 16 84 Line 3 1 4 30 70 Line 4 1 7 34 66 Line 5 1 12 43 57 Line 仅供学习与参考 学习资料 6 1 22 55 45 Line 7 1 25 55 45 Line 8 1 34 98 2 Line 9 1 38 16 84 Line 系统开始重新平 10 1 40 16 84 衡，恢复到初始 状态 四、计算方法 定性和定量方法 (1)根据保留时间和紫外吸收谱进行定性分析。 (2)外标峰面积法进行定量测定。 (3)计算 a.标准曲线的绘制 以不同浓度的氨基酸标准液测得的峰面积为纵坐标，氨基酸含量为横坐标 绘制标准曲线，得到回归方程： Y=kX 式中Y ：峰面积 X ：氨基酸标准品浓度 b.发酵液中氨基酸含量计算方法 X= A/k 式中X:发酵液中氨基酸含量，g/L A ：样品的峰面积 k : 回归方程所得值 仅供学习与参考 学习资料 仅供学习与参考