分离机使用培训教程.pptVIP

（1）等电点沉淀法（Isoelectric point precipitation） 粗分离技术 沉淀后的蛋白质不变性 沉淀可能不完全 加酸/碱时一定要搅拌缓慢，防止局部过酸/碱 可用于去处杂蛋白或核酸 等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。 （2）盐析法 盐溶 盐析 原理： lgS = ? - Ks * I I = ∑CZ2/2 ? ：主要取决于蛋白质的性质和溶液的温度与pH Ks ：主要取决于盐的性质。Ks越大，盐析效果越好 影响因素 蛋白质本身的因素：即不同的蛋白质其发生盐析的条件也不同 如血浆蛋白质的盐析（Ks分段盐析） 蛋白质 盐析时硫酸铵的饱和度 纤维蛋白原 20% 优球蛋白 33% 拟球蛋白 40% 清蛋白 62% 影响因素 中性盐的种类与离子强度 lgS = ? - Ks * I ； I = 1/2 ∑CZ2 硫酸铵 氯化钠 硫酸铵浓度（饱和度）的计算与调整 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵. 它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为，即767克/升； 0度时饱和溶解度为，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来； 另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。 硫酸铵溶液的pH常在之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 影响因素 温度: 除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。 一般温度低蛋白质溶介度降低。 但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。 影响因素 PH: 大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。 在一定的PH和温度条件下，改变离子强度的盐析叫Ks分段盐析 在一定的盐和离子强度条件下，改变PH和温度的盐析叫?分段盐析 影响因素 蛋白质的浓度 小比大好，但一般以2.5 ~ 3%为宜。 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。 因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 实际操作时的注意事项 硫酸铵的纯度要高 通过小试或资料确定硫酸铵的饱和度 确定硫酸铵的添加方式和添加量 加盐的速度要适中 在硫酸铵饱和度较高时才发生盐析的蛋白质沉淀需离心 盐析常常和等电点沉淀协同进行 盐析可以在常温下进行 盐析沉淀的蛋白质含有较高的盐 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去。 常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 （3）有机溶剂沉淀法 （冷乙醇、冷丙酮） 原理：破坏蛋白质的水化层并降低溶液的介电常数 低温操作 添加的中性盐可以减少有机溶剂引起的蛋白质变性，并可以提高蛋白质的分离效果 在酶的分离纯化中，使用该方法时，应注意以下几点。 （1）由于有机溶剂易使酶发生变性，因此使用该方法时应该在低温下进行。酶沉淀分离后，也应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。 （2）有机溶剂沉淀法析出的酶沉淀一般比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去，但有机溶剂沉淀法易使酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。 （3）添加的中性盐可以减少有机溶剂引起的酶变性，并可以提高酶的分离效果。但由于中性盐会增加酶在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。 （4）有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离酶的等电点附近。 （4）PEG沉淀法 PEG：聚乙二醇 （polyethylene glycol），是一种具有螺旋状和强亲水性的大分子物质，在生化分离中常用的是PEG2000-6000 基本原理：利用空间排阻效应 lgS + f = x – a c 影响因素 蛋白质的大小：蛋白质的分子量越大其被沉淀下来所需要的PEG浓度越低 蛋白质的浓度：浓度高，易于沉淀，但分离效果差，因此以小于10mg/ml为好 PEG的聚合度：PEG的聚合度越高，沉淀蛋白质时所需要的浓度越低，但分离效果差，一般用常用的是PEG2000-6000 其他影响因素 温度：PEG对酶（蛋白质）有保护作用，因此可以在常温操作，且一次可处理大量样品 PH：越接近PI，越