肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展（职称论文资料）.docVIP

肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展（职称论文资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 5 文2：肠球菌耐药性变迁情况分析 8 1 材料与方法 9 2 结果 10 1996～1997年检出的肠球菌耐药情况 11 2006～2007年检出肠球菌的耐药情况 11 3 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展（职称论文资料） 文1：肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展 肠球菌的感染和耐药性是目前国内外关注的重要课题和难点。美国疾病控制中心(CDC )医院感染监测系统(NISS)调查表明，肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一，并 且肠球菌的分离率不断上升。尤其多重耐药(MDR)肠球菌的出现，特别是高水平氨基糖苷 类耐药(HLAR)肠球菌以及耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现，其耐药性和耐药水平越来越 高，成为抗感染治疗的新挑战。近年来，随着分子生物学技术的发展，具有分辨力强、分型 率高和重复性好的RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究，并显示出较好的应 用前景。RAPD分型法是1990年内Williams和Welsh等建立的一种以PCR为基础的提示基因同源 性和基因多态性的方法，该法最大特点是可对模板序列未知，而随机引物可以是任意的单链 寡聚核苷酸片段。同时可通过在RAPD分型的基础上，进行与其耐药性关系的研究，可在基因 水平上对临床细菌的耐菌性进行测报。因此，肠球菌的基因分型鉴定对于其流行病学分析和 感染控制具有重要意义。为此，我们收集临床分离的64株肠球菌进行RAPD分型技术已应用于 肠球菌的基因分型和相关研究现报告如下。[1-4] 1 材料与方法 菌株 2006年6月至2009年10月本院住院患者的尿液、痰液、大便、 分泌物、胆汁、前列腺液、血液等临床标本中分离的64株肠球菌，已经系统鉴定。 细菌DNA的提取 将64株肠球菌 分别接种于血平板，35℃培养18～24h。用接种 环将菌落分别接种于5ml的普通营养琼脂(LB)液体培养基中，35℃恒温摇床过夜，取 菌液离心收取菌体，酚氯仿法抽提后DNA，分光光度法测定抽提后DNA的纯度，A260/A280为1 .82～之间，符合DNA样品要求，置-20℃冰箱保存备用。 RAPD反应体系条件的优化 引物的设计 RAPD引物共6条，5条为10bp的引物，1条为9bp的引 物。序列15′-GAAGTCGTLL-3′，序列25′-TCACGCTGCA-3′，序列35′-GGAGGGTGTT-3′， 序列45′-AGGGAACGAG-3′，序列55′-ACGCGLCCT-3′，序列65′-GGGATGGAAC-3′。由上海 生工生物工程公司提供。 RAPD引物、Mg2+ 浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数 的反应条件优化在 50μl PCR反应体系中含被筛选的随机引物之一2μl(10pmol/L)，10×buffer5μl dNTP0. 4μl(/L)，Mg2+浓度、、、、/L，Taq DNA溶酶 、、、，DNA模板μl循环参数94℃预变性3min后，再经94℃1min，35 ℃1min，72 ℃2min各35、40、45、50个循环后72℃延伸5min，取5μl扩增产物加上2μl上样6×buffer ，经%琼脂糖凝胶(内含μg/ml EB染料)电泳，85～100V电泳1h，同时用DNA marker 作标准，紫外分析仪下观察并拍照，进行RAPD结果比较，观察RAPD分型指纹图，确定RAPD分 型技术的优化条件反应体系。循环参数为94℃预变性，再经94℃1min、35℃1min、72℃2min 、45个循环后经72℃延伸5min。随机6株不同DNA指纹的样本在优化反应体系下重复检测3次 ，观察DNA指纹图谱。 2 结果 RAPD反应体系的优化 随机引物的筛选 每次RAPD分析加入6条随机引物之一， 结果显示引物AW96628，序列3为5′-GGAGGGT-GTT-3′和引物AW96627，序列2为5′-TCACGCT GCA-3′均能对肠球菌产生特征RAPD谱型，而引物AW96628产生的RAPD指纹图谱，扩增条带最 清晰，分辩率最高，为最佳引物，其它4条引物菌株出现RAPD指纹图谱，条带少，不够清晰 ，没有长、中、短片段分布。 Mg2+浓度的影响以Mg2+浓度为/L时扩增条带最清楚，长短片段分布均匀，扩增效率最高。 Taq DNA聚合酶的影响Taq DNA聚合 酶为时，扩增带亮度最强，产物