DB37∕T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术.docx

ICS 67.050 CCS X 04 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4415—2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中 β-乳球蛋白的检测技术 Detection of β-lactoglobulin gene knockout cow and β-lactoglobulin in cows milk 2021-10-18发布 2021-11-18实施 DB 37/T 4415—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 I DB 37/T 4415—2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术 1 范围 本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛 奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。 本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 NY/T 1663—2008乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 NY/T 1672—2008绵羊多胎主效基因Fec分子检测技术规程 B NY/T 2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 SN/T 2497.16—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第16部分：Western-Blot实验 农业部2031号公告-14-2013 转基因动物及其产品成分检测 普通牛 (Bos taurus)内标准基因 定性PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛β-乳球蛋白基因 Bos taurusβ-lactoglobulin BLG BLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1），简称PAEP，来源于普通牛（Bostaurus）， 编码β-乳球蛋白的基因。 注：基因全长4900bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸。 3.2 β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulin knockout cow 利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。 4 聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性检测 4.1 原理 通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基 因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。 1 DB 37/T 4415—2021 4.2 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水：GB/T 6682，三级。 4.2.2 50×TAE缓冲液：称取Tris-base242.2g，加入冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL， 用水定容至1000mL。使用时，用水稀释为1×TAE。 4.2.3 1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。 4.2.4 BLG基因引物： ——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′； ——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′； ——预测野生型扩增片段大小为6728bp。 4.2.5 4.2.6 内标准基因引物：参照农业部2031号公告-14-2013。 引物溶液：引物用水稀释到10μmol/L。 4.3 仪器设备 4.3.1 PCR扩增仪：温度范围4℃～99℃，温度梯度范围20℃，模块单元96×0.2mL。 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2mL。 电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。 凝胶成像分析系统。 稳压稳流电泳仪：输出电压0V～600V，输出电流0mA～100mA。 高压灭菌锅：使用温度范围45℃～135℃，最高使用压力0.255Mpa。 微波炉。 4.4 样品 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 采集静脉血样3mL～5mL，医用抗凝管或ACD抗凝，-20℃以下保存。 采集组织（耳组织等）0