分子生物学实验课件：7重组克隆子的酶切鉴定.pptVIP

* 实 验 七 重组克隆子的酶切鉴定 背景理论知识 Section 1 7.1.1 实 验 目 的 了解转化子鉴定原理，掌握各方法适用的情况 质粒快速抽提试剂盒、酶切鉴定上次实验的转化子 重组子鉴定可从以下水平进行： DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位杂交 Southern杂交 DNA顺序分析 PCR检测 mRNA水平： RNA杂交 反转录-PCR 蛋白质水平：免疫沉淀检测法 功能水平： 抗性反应 显色反应 酶切和电泳方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析 转化子的分析——Southern杂交 本次实验方法 试剂盒快速抽提质粒DNA、酶切鉴定转化子 实验操作 Section 2 1、挑选阳性克隆子培养(已做) 2、抽提质粒 3、酶切分析 4、电泳鉴定 7.2.1 【实验步骤】 1.5-5ml过夜培养菌液,倒入EP管中(标记), 10000rpm离心1min,弃上清。（已做） 加入250μl 溶液I（含RNase A），充分混匀。 加入250μl 溶液II，轻轻混匀，室温放置2min。 加入350μl 溶液III，轻轻混匀，13000g离心10min。 将上清液转移至纯化柱中（标记），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。 2、抽提质粒(每人提取2个样品:1个PCR证明有插入片段的菌,另1个菌由杨老师提供) 在纯化柱中加700μl DNA漂洗液（含70%乙醇），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。 重复步骤6。 再次13000g离心2min,用于干燥纯化柱。 丢掉下层收集管，将纯化柱放入新的1.5ml EP管（标记）。 小心加入30ul 50-60度预热的Elution Buffer（T buffer or 纯H2O）（要加到柱子正中间，是液体均匀扩散到DNA吸附填料上），室温放置2min，13000g离心1min，下层新EP管中液体为所纯化的质粒DNA。 3、酶切分析(每人做2个样品) 无菌ddH2O upto 10 μl 10xbuffer 1 μl 质粒DNA 5 μl BamHI 1 μl NotI 1 μl 总体积 10 μl 混匀后, 离心(Short), 37℃酶切50分钟 *