分子生物学实验课件：诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测.pptVIP

* 实 验 十一 诱导表达蛋白的SDS电泳检测 背景理论知识 Section 1 11.1.1 实 验 目 的 了解SDS电泳实验原理 掌握SDS电泳实验操作 灵活运用SDS电泳方法检测蛋白质 带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比,而与颗粒半径(分子量和结构)和介质粘度成反比 若样品为混合的蛋白质溶液时,由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的,因此经电泳后,就形成了泳动度不同的区带 11.1.2 实 验 原 理 结构因素——蛋白质的变性消除 (1)强阴离子去污剂:十二烷基磺酸钠(SDS) (2)还原剂:二硫苏糖醇(DTT) (3)物理作用:加热 电荷因素——SDS结合消除 (1)变性的多肽与SDS结合因而带负电荷 (2)多肽与SDS结合的量与多肽的分子量成正比 (3) SDS多肽复合物的迁移率只与分子量相关 分子筛作用 分子量大的蛋白质泳动的速度慢,分子量小的蛋白质泳动的速度快 SDS电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂(如过硫酸铵)和增速剂(如N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED)的情况下聚合而成的。丙稀酰胺的聚合通常是由化学催化或光化学过程完成的,常用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素来引发这个过程，用TEMED、3-二甲胺丙腈等作为聚合过程中的增速剂。 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶三维结构 聚丙烯酰胺凝胶是由通过N,N’-亚甲双丙烯酰胺交联的丙烯酰胺聚合链组成。 形成的孔径随双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而变小。当比率为1:29时，可分离大小相差只有3%的多肽。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 （聚）丙烯酰胺% 线性分离范围（KDa） 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积(浓缩)作用，可使样品(即使是稀释样品)在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度(或一定浓度梯度)的凝胶上进行分离。 原理： 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 不连续PAGE电泳 Tris-甘氨酸不连续缓冲系统 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。上下槽缓冲液中含Tris-甘氨酸(pH 8.3)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 浓缩胶(Tris Cl pH6.8)，分离胶(Tris Cl pH8.8)，电泳槽缓冲液(Tris-甘氨酸)的pH值与离子强度均不同。 实验操作 Section 2 诱导表达产物(自己上两次实验制备的样品) SDS系统(北京六一) 电泳仪 中分子量蛋白质Marker 11.2.1 实 验 材 料 11.2.2 实 验 步 骤 凝胶板的制备 点样及电泳 蛋白质的染色和脱色 密封条 梳子 平,凹玻板 斜楔板 电泳槽 凝胶的制备 装配 将密封硅胶框放在长板上(图1)，将短板与长板重叠(图2)。 1 2 凝胶的制备 3 4 将两块玻璃板立起来使其底部接触桌面(图3)，用手夹住放入电泳槽内，短板面向身体，插入斜楔板到适中程度(图4)。 凝胶的制备 凝胶的制备 制胶 分离胶(下) 浓缩胶(上) 成分 (2人一组) 总体积