酶组织化学概论PPT课件2.ppt

* * * * （一）生物化学方面的要求 酶组织化学的基础是组织化学，而化学反应又是组织化学的基础。所以化学反应的各种条件和影响化学反应的各种因素都要考虑到。 酶是一种催化剂，但其并不参与化学反应本身，只是起到加强酶组织化学反应，显示出酶活性的高低的作用。影响酶活性的因素有多种，如底物的浓度、反应产物的强弱、温度、pH值和试剂质量等。同一种酶，在不同条件下，所显示酶的活性可以相差悬殊。因此，在进行酶组织化学研究时，应极其重视化学反应的良好程度，严格控制实验条件，这样才能对获得的结果作出科学的判断和分析。 * （二）形态学方面的要求 1、尽可能保持组织细胞生活时的形态和结构。 2、尽可能保持组织细胞生活时的化学成分和酶的活性。 3、染色法是已知的化学反应，各种条件均可控制。 4、反应产物是一种有色的沉着物， 颗粒要细，并能保留在原位。其颜 色深度与物质含量或酶活性具有一 定量效关系。 5、显示的可视物质必须具有稳定性， 以利于反复观察。 6、反应产物要具有特异性。 肿瘤细胞SDH：四唑盐法 * （三）酶组织化学的局限性 1、定位方面的局限性： 酶组织化学要求是使某一物质在原位上显示出来。但由于吸附、弥散和溶解等现象，其定位的改变或假定位是多见的，给分析结果带来很大困难。在进行酶组化染色反应时，用恒冷箱切片法、控制孵育条件、温度、pH值和时间可防止反应产物扩散。 酶组化 大致定位 核仁、胞质、C器等 电镜细胞化学 微细定位 C器的微细结构 分子水平定位 * 影响酶定位的因素 必要条件 要求 底物 1、必须容易被水解 2、底物应尽可能纯 反应产物 1、既不溶于水也不溶于脂中 2、必须易染，既有较高的着色指数或转化为易着色产物。 偶联剂 对反应产物必须具有高度偶联率。 * 2、定性方面的局限性： 由于组化是利用已知的化学反应来显示细胞内化学成分的性质，所以它具有特异的定性的优越性。但同样有局限性。 （1）非特异性的问题：有些方法的原理是根据某些特殊基团或某些特性，不可避免地造成一些非特异性染色。 （2）定位的不精确：如PAS法显示糖原。 （3）有些物质被掩盖，不能全部显示出来。如隐式脂肪。 为了确切定位，组化染色反应中，必须有对照试验。可以极大的提高定性的可靠性。 * 3、定量方面的局限性： （1）原因：定量不精确是酶组化的最大局限性，它不同于试管中的化学分析，而是在极复杂的细胞微环境内进行化学反应，所要研究的物质或酶的活性，均受到细胞内其他物质和细胞外各种因素的影响。有些因素的性质不明，难以控制。组化反应产物都呈现可视的有色沉着物，存在于细胞内不均匀的复杂结构中，不可能像化学反应在试管中得到的均质的产物，也不可能进行精密的光谱吸收分析。 * 常用的组化定量方法使用加号与积分法表示的。以中性粒细胞中碱性磷酸酶活性的评级说明。 （2）定量方法： 符号 等级 着色强度 - 阴性 + 弱阳性 浅灰/棕色沉着物，弥散、无致密颗粒 ++ 较强阳性 均着色/棕黑色致密片状物，占胞质1/2 +++ 强阳性 充满棕黑色颗粒，致密块状沉着物较少 ++++ 极强阳性 深黑色，充满致密块状沉着物,可遮掩C核 * ALP活性可以用阳性率或阳性强度表示。但阳性率不能鉴别两种不同状态。因此需用积分法表示阳性强度，才能作出准确判断。见下表： 用阳性率表示时，无区别；用积分法表示后，发现呈显著区别。此法是估量法——半定量技术。 0 20 * （3）发展趋势： 一是更精确的定位：电镜细胞化学 二是更专一的定位：免疫组织化学 三是更准确的定量：定量细胞化学 （4）定量细胞化学目前常用的仪器与技术： 显微分光光度计、显微荧光光度计、流式细胞光度计、电镜X射线显微定量分析技术、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以及图像分析技术等。 * 五、影响酶活性的基本条件 酶组织化学方法的四个步骤： 第一 ：酶的固定(fixation)。 第二：酶的特异性反应（specific reaction)。 第三：在最适条件下，酶反应产物沉着(pricipitation)。 第四：使沉着产物具有可见性(visualization)。 * 组织、细胞标本的制备步骤 * (一）固定和切片标本的制作 1、固定剂的性质： （1）既要保持组织细胞的微细结构又要保持酶的活性。 （2）既不能溶解酶也不能使酶活性部位发生移位。 （3）既不能抑制酶反应也不能 和其它步骤使用的试剂发生反应， 引起人为的产物。 因此要根据酶的不同性质 选择固定液的种类。酶对任何固定 液都是敏感的。 * 2、固定对酶活性的影响： * 3、切片厚度对酶活性的影响 切片厚度：40μm，一般为8μm--12μm。 原因： （1）切片厚度60μm时容易出现人工假象，浸透速度减慢。切片的厚度在40μm以