现代分子生物学复习笔记.pdfVIP

现代分子生物学 1.全自动测序仪:原理:在DNA 片段中加入4 种被巧光分别标记的ddNTP 做为引慨ddNTP 的 作用是链终止剂，当进行PCR 时，遇到ddNTP 便会停止，因此会形成链长度不一的一系列片段， 由于每个片段末端标记的巧光不同用激光探头扫描电泳后形成的按大小顺序跑出的条带，即可读出 核巧酸序列。①在片段中需加入4 种不同的ddNTP②加入PC 民需要的模板，Tap 聚合酶，缓冲液， 及dNTP ，进行单向PCR ，产生长度不同的一系列片段。⑨将PCR 扩增出的片段进行PAGE 电泳， 其电泳后只跑出一个带④用激光探头 扫描条带，即可读出相应序列。 2. (blue-white screening)蓝白斑筛选：是一种可W 在同一转化板上完成重组质粒的筛选方法。 次方法涉及基因的插入失活，利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂，在这种情况下失活的基因是 lacZ ，该基因编码日-半乳糖甘酶，受到启动子的调控，当大肠杆菌菌株表达lac 阻抑物，则载体那 个的lacZ 基因由IPTG 诱导表达，表达形成的酶可W 利用底物X-gal 形成蓝色化合物，重组质粒中 lacZ 的插入失活导致不能形成蓝色菌落而形成白色菌落。 3. 五种重要的工具酶： ①碱性磷酸酶：从DNA 或RNA 的5端去除磯酸基。 ②DNA 连接酶：5-磯酸与3-径基相结合。 ③DNA 聚合酶1:沿5至3的方向合成与 DNA 模板互补的DNA 。 ④多核巧酸激酶：一个依赖ATP 的反应，向双链或单链 DNAiRNA 的5-哲基末端添加磯酸基。 ⑤末端转移酶：可将核巧酸加到单链或双链DNA,RNA 的3端。 质粒小量质备：仅从几毫升培养液中提取小量质粒用作分析的过程。 过程：1 将携带有目的质粒的大麻杆菌接种于数毫升的液体培养基中进行培养。 2 增至稳定期后，离也液形成菌体沉淀 3 用碱裂法提取DNA (重悬碱裂体一中和） 4 酪抽提除去蛋白污染物 5 乙醇沉淀，对DNA 及RNA 进行浓缩 （可加入RNaseA 降解RNA) 6 在适宜的缓冲液中进行悬浮。 不连续复制：在DNA 复制中，两条新生链的合成在同一复制叉中同时进行，因DNA 复制时只 能W5*-3方向进行，所W 两条链中的一条链（即前导链）从起始点按5,-3方向进行连续复制， 而另一条链(即随后链)从复制叉处起始按5*-3,方向反向形成冈崎片段，随着复制叉的前进，前导 链被复制成连续长链，而滞后链形成不连续的网崎片段，之后被 DNA 连接酶连成连续的DNA ，因 此称为半不连续复制。 克隆技术的应用有：重组蛋白的生产，遗传修饰生物体的构建，DNA 指纹分析，医学诊断及基 因治疗等。 DNasel 足迹法可确定与蛋白质作用的DNA 实际序列区域。将末端标记的DM 片段与蛋白质样品 相混合，待相互泥合后用DNasel 对复合物进行温度配对。在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近 DNA 骨架而难W 切割，再将酶解的DNA 进行PAGE 电泳分析，在对照DNA 的泳道中的说状显示 出所有随机的酶切割部位而在加入蛋白样品的泳道显示出某些带的空缺或未切割的区域，即对应于 蛋白结合的DM 位点（足迹） (嵌套式）PCR :在第二次PCR 中，W 第一次PCR 的底物作为模板，使用一套新的引物，形成更 短的PCR 产物。可W 避免非特异性产物的产生，排除其它基因成员，保证得到较纯的目的产物。 Southern 印迹：用来检测琼脂糖凝胶上众多DNA 分子中能与特定探针杂交的DNA 分子。DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳后，通过毛吸作用转移至尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用碱变性使DM 分子转变 成单链DNA，然后干燥使DNA 固定在膜上，膜上DM 的位置与凝胶中的完全相同，固定后用巧光标 记的探针与其进行杂交，充分洗洛后，用放射自盛影法检测杂交的探针，从 而检测出DNA 分子 4. 滚环的复制过程和特征：过程：在DNA 复制过捏中，W 某种方式切断双链DNA 中的一条链。 其5’端与特珠的蛋白质相连，3端由DNA 聚合酶催化延伸。W 未切断的一跳 球形链为模板加上新 的核巧酸，由于3端不断延长，而5端不断被甩出成为游离的单位，好像中间的环不断滚动一样， 当游离的链达到一定程度时开始复制其互补链。特征：①链的延伸不需要引物。②模板是环状的③ 单向复制I 形成