冰冻切片的免疫荧光.pdfVIP

中山大学附属第一医院肾内科实验室 免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接 OCT 包埋，或灌流后的组织 30%蔗糖溶液 4 ℃过夜 后， OCT 包埋。 -20℃保存 3 月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。 2，冰冻切片机切片至少 10um，空气干燥 2 分钟后， -20 ℃储存 3，切片从 -20 取出后，在通风橱放 10-30 分钟以去除水汽， 4%PFA 固定 15 分钟，或 -20℃丙酮固定 15 分钟置通风橱 2 小时 4, 1XPBS 清洗玻片， 3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复 3 小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的 抗原修复方式 （真空负压.微波修复 .高压修复 .隔水加热 .电炉加热） … 关注修复的温度 ，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的 时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律， 使用足量的抗原修复液… 选择不同 PH 值的修复液（ A 液 枸盐酸缓冲液 PH6.0， B 液 EDTA-Na 缓冲液 PH8.0， C 液 枸盐酸缓冲液 PH4.5） 6，室温封闭 1 小时 封闭液： 5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液： 1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS （细 胞因子，无需封闭的蛋白 中山大学附属第一医院肾内科实验室 7，一抗 4 ℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗， 1:1000 （alexa 系列） 1:300 （dyelight )in 封闭液，避光室 温 1 小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核 5min ， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片， （避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后 4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定 -脱水 -包埋（见随后操作步骤 ) ，制成石蜡 包块 2 ，组织学染色切片厚度 2um，免疫荧光染色切片厚度至少 6um， 切片复水： 58 ℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min- ， DDW5min 中山大学附属第一医院肾内科实验室 4, Rinse 玻片 1xPBS, 从此请保持玻片湿润 5，抗原修复过夜。为此请： 选用稳定的抗原修复方式 （真空负压. 微波修复 .高压修复 .隔水加热 .电炉加热）… 关注修复的温度 ，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间） ，抗原修复液必须 遵循自然降温规律， 使用足量的抗原修复液 …选择不同 PH 值的修复 液