HPLC分析方法的建立与开发.ppt

HPLC分析方法的建立与开发;色谱分离度与分离性能;HPLC分离的机理 ;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;液相色谱流动相及固定相;HPLC分析方法的建立与开发;3）对待测物具一定极性和选择性 4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂 5）适宜的粘度 ★粘度过高，柱压增加 ★过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡 ;2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。 ;3、流动相的选择 4、梯度洗脱 特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移 ;HPLC分析方法的建立与开发; 载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为： ? 可以制备成粒度分布窄的多种粒度 ? 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床 ? 长期高压操作下不变形 ? 反压较低、柱寿命长 ? 较其它材料制成的柱有更高的柱效 ? 适用于小分子、大分子的分析和制备 ? 高pH值下会分解（pH＜8）;键合方法： （l）硅酯化（≡Si-O-R）键合固定相 （2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相 （3）硅烷化（≡ Si-O-Si-R）键合固定相 使用键合固定相应注意的问题 ? 硅胶键合相的稳定性 ? 键合相色谱分离的重现性 ? 键合相色谱分离的选择性 ? 键合相色谱柱的再生 ;化学键合相色谱法;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;正相色谱;HPLC分析方法的建立与开发;流动相： 在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。 主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。 ;HPLC分析方法的建立与开发;流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点;HPLC分析方法的建立与开发;分析方法建立;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;HPLC分析方法的建立与开发;2、选择分离条件，进行第一次分离 ;选择流动相 在反相色谱中常用水/乙腈 pH的选择思路 ? 选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性 ? 低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小 ? 初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂;!;!;3、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围;反相保留太弱的样品 改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱;4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B% 5、评价第二次运行中峰的质量--柱效、峰宽、峰形 ★峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等） ★运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间;6、 对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 ★若有必要， ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH% ★可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化 7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件;8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度 ★结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型 ★分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度