微生物实验课药敏试验.pptxVIP

药 敏 试 验概念什么叫抗菌药物？等同于抗生素？MIC折点ESBLsMRS抗菌药物：具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌的代谢产物，对特定细菌或肿瘤细胞具有杀灭或抑制作用（天然产物）而后者是指经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物，在抗感染中发挥重要作用。MIC：指抗菌药物能够抑制微生物生长所需的最低浓度。折点：药敏试验结果的解释标准CLSI ESBLs:指由质粒介导的能水解所有青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类的一类酶，但是能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等β内酰胺酶抑制剂所抑制。MRS:对甲氧西林等耐青霉素酶药物耐药的葡萄球菌，称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS)。其耐药机制为葡萄球菌细胞内含mecA基因，介导产生新的青霉素结合蛋白2a，致使与β内酰胺类药物亲和力减低所致。目的要求了解药物敏感试验的方法和实际意义掌握纸片扩散法的原理及结果判读了解稀释法和E试验的原理和方法了解ESBLs和MRS的检测方法药敏试验常用方法：1. 纸片扩散法（Disk Diffusion Test）： Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法）2. 稀释法（Dilution Test）： 琼脂稀释法和肉汤稀释法3. 抗生素浓度梯度法-E 试 验（E-test）纸片扩散法原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。纸片扩散法操作程序---准备MH培养基:pH为7.2∽7.4琼脂厚度为4mm---准备菌悬液:0.5麦氏浊度的菌液(15min内接种完毕)---涂布平板:均匀接种---贴含药纸片： 各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm---孵育:35?C孵育箱16 ∽ 18h---测量抑菌环直径:游标卡尺(精确度为0.1mm)---结果解释：根据CLSI标准试验程序注意事项接种时均匀密涂贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之与培养基充分接触贴片后不能再更改纸片位置镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响整个贴片过程应在15min内完成 稀释法：琼脂稀释法将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。MIC：稀释法所测得的某抗菌药物能抑制被检菌肉眼可见生长的最低浓度琼脂稀释法具体实验步骤：1. 抗菌药物储备液的配制：将各种抗菌药物制备成琼脂稀释法试验需要的药物浓度。2. 含药琼脂培养皿的制备：将灭菌熔化的M-H琼脂在水浴中平衡至48～50℃，培养皿置超净台上。将稀释好的中间浓度的抗菌药物溶液2mL与18mL M-H琼脂混匀，立即倒入培养皿中，培养基厚度约4mm。待培养基冷却并使琼脂表面的水份蒸发干后备用。3. 接种：将试验菌株在普通琼脂上划线培养，挑取4～5个形态特征一致的菌落接种于无菌M-H肉汤中培养8h，用生理盐水调节菌液浓度使其为0.5麦氏标准管浊度（1.5×108CFU/mL)，然后再用生理盐水稀释10倍，在15min内用定量接种器吸取1～2μL接种于制备好的M-H琼脂表面。并做好标记，标明接种点的位置。首先接种无药对照平皿，随后从最低药物浓度开始依次接种不同浓度的药物平皿。接种后的平皿在室温下静置，待接种点水份被琼脂吸收再将平皿反转，于37℃培养18～24h。4. 结果判读：首先检查不含抗菌药物的对照组平板，必须每一菌株都有生长。平板放在黑色不反光的表面上观察，记录能完全抑制细菌生长的抗菌药物的最低抑菌浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。生长稀少或仅有一两个菌落的可忽略不计。如果低浓度药物平皿无菌，高浓度药物平皿却有细菌生长，应重复试验，检查待测细菌的纯度。5.质量控制：每个琼脂平板应同时接种标准菌株（如大肠杆菌ATCC 25922）作为质控菌。 稀释法：肉汤稀释法（一）常量稀释法实验步骤：1. 取无菌小试管10支排于试管架，于第一管加入MH肉汤1.9ml，2～10管各加1ml。2. 于第一管加入稀释好的2560μg/mL的药物原液0.1ml，混匀后取1ml加入第2管，依次对倍稀释，自第9管吸出1ml弃去，第10管为对照管。各管中的药物终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/mL。3. 另设测试菌生长对照管一支不含药物。将已调节好的待测菌悬液加入加到各含药管内，使每mL含细菌约5×105CFU/mL。4. 各试管置37℃孵育16～24h后观察结