1微生物保藏及基本操作技术.pptxVIP

微生物保藏及基本操作技术;微生物菌种保藏;微生物菌种保藏;微生物菌种保藏;常用菌种保藏方法;定期移植法; 接 种;定期移植法 操作简单，使用方便； 对设备和人员要求不高； 可随时使用，便于观察菌种； 工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高； 菌种传代频繁，易退化、污染。;液体石蜡法; 操作步骤：;液体石蜡法 操作简单，使用比较方便； 对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；· 菌种易退化、污染。;真空冷冻干燥法;安瓿管的准备 清洗 选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。 棉塞 打棉塞，160℃定型2h； 标签 激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。 灭菌 121 ℃，30min.;保护剂的准备 保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却； 30℃培养2天，无菌检查合格后备用。 ;冻干样品制备 制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。;真空干燥 在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。 终止干燥时间应根据下列情况判断： 安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结 ;预冻 制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h； 分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结； 可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min； 采用离心式冻干装置时勿需预冻。;熔封 将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈； 将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封； 拉管时注意火焰不要离菌体太近。 ;真空度检测 用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝 光，说明真空度符合要求。 ;真空冷冻干燥法 保藏、运输方便； 保藏时间长(5 ～10年)； 对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高； 冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。;-80℃冰箱冻结法;-80℃冰箱冻结法 使用方便； 保藏时间较长； 对设备要求高(-80℃冰箱)； 运输不方便。;液氮超低温冻结法;操作步骤 冷冻管准备 保护剂制备 保藏培养物准备 预冻 — 将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃； — 使用程序降温盒。 保藏 将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。 ;液氮超低温冻结法 保藏时间长； 保藏效果好，菌种不易退化； 对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高； 保藏成本高。 ;不同保藏方法的比较;菌种保藏技术进展; 原位低温保藏技术 有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。;包埋固定化技术 是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。;玻璃化技术 就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。 对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才能实现“玻璃化”。 ;标准菌株要求;国内认可的菌种收藏机构;国认外可的菌种收藏机构;菌株代数;标准菌株提供形式;