甜瓜比较基因组揭示逆转录转座子在基因表达中的作用.docxVIP

甜瓜比较基因组揭示逆转录转座子在基因表达中的作用 导读 甜瓜是重要经济作物，起源于印度或亚洲其他国家，其果实表型发生了许多自然变异，尤其在果实成熟生理方面，包括呼吸跃变果实型（成熟时产生乙烯并呼吸骤停）和非呼吸跃变型果实类型。鉴于乙烯对果实贮藏期和成熟期性状的调节作用，对产生乙烯的分子机制进行研究具有重要意义。 甜瓜基因组由12条染色体组成，基因组大小~454Mb。第一个甜瓜全基因组是DHL92，包括337Mb的核苷酸序列和79.6Mb的模糊碱基（NNN），包含29980个蛋白编码基因，而目前甜瓜基因组的结构变异，尤其是拷贝数变异（CNV）和插入/缺失多态性（PAP）的研究较少。本研究采用ONT（牛津纳米孔技术）全长基因组测序结合BioNano光学测序和Illumina高通量测序方法，构建半呼吸跃变日本网纹甜瓜（Cucumis melo?var.reticulatus）的全基因组序列。基于ONT全长转录组测序鉴定出33829个蛋白编码基因，识别PAP及逆转录转座子位点。结合比较基因组和转录组分析，本研究认为逆转录转座子在甜瓜基因组遗传变异过程中基因表达的修饰和果实成熟诱导基因的进化发挥作用。 实验设计 结果 1?甜瓜基因组的组装和比较 ? 本研究选择甜瓜品种Harukei-3（一种日本高级甜瓜），外观如图1a所示。与Pacbio相比，ONT测序产生更多长序列片段，N50=8.6Mb（图1b）。基于Bionano测序后获得80条scaffolds，N50=17.5Mb。基于Pacbio测序，利用最终的28条scaffolds构建12条染色体序列，与先前研究的连锁图谱进行比较时完全共线（图1d），表明组装是正确的。对Harukei-3和DHL92进行基因组比对，大部分比对结果呈共线性，而有部分染色体易位（图1e）。此外，Harukei-3基因组显示一个大的序列重复（120kb，在5号和9号染色体）。 ? 为研究基因组的基因信息，对Harukei-3序列进行基因预测。使用ONT RNA-seq获得接近全长的mRNA分子序列，共鉴定出33829个蛋白编码基因（33314个核基因+515个细胞器基因）。然后，利用BLAST比对分析Harukei-3和DHL92基因组的同源关系（图2a）。Harukei-3的33314个核基因中，24747个与DHL92直系同源，1203个基因是CNV和PAP的候选基因。将一个共有的基因标识附加到Harukei-3基因组的24，747个直向同源基因上(一个以“MELO3C”字符串开头，以“. jh1”字符串结尾的基因标识)，以帮助在甜瓜基因组中保持一致的基因命名(图2b)。 ? 图1 Harukei-3甜瓜全基因组组装。a，Harukei-3甜瓜果实外观；b，ONT和PacBio测序长度分布图；c，染色体图谱；d，基因组与连锁图谱的比较；e，Harukei-3和DHL92基因组共线性比对。 ? 图2 Harukei-3和DHL92的基因组比较。a，比较基因组圈图。蓝线表示直系同源，灰线表示同源基因，紫线表示串联重复序列，红线表示拷贝数变异和插入/缺失多态性，橙线表示未锚定的基因；b，Harukei-3基因ID的重命名，MELO3C表示与DHL92的同源基因。 ? 2 果实成熟基因的共表达分析 ? 由于Harukei-3果实在成熟过程中产生乙烯，本研究选择乙烯相关基因进行分析（图3a）。RNA-seq共鉴定27687个基因，权基因组相关网络分析（WGCNA）鉴定60个共表达簇。其中，成熟果实中乙烯相关基因（CmACO1、CmETR1/2、CmNOR-NAC）表达上调（图3b）。共表达分析中一个特定的果实成熟表达簇包括乙烯相关基因、81个NAC结构域蛋白，42个MADS-box转录因子（图4a）。这一基因簇的中心域，有一个花器官发育的关键调节因子AGAMOUS（MELO3C019694），这一基因也是调控果实成熟的候选QTL。分析MELO3C019694的基因序列，发现其上游启动子区域含两个含末端重复序列的逆转录转座子（图4b）。在这个基因周围，有两个逆转录转座子相关蛋白编码基因，其中MELO.jh102711.1编码蛋白具有逆转录转座子Gag结构域、逆转录天门冬氨酰蛋白酶结构域、逆转录结构域。而且，MELO3C019694和邻近的逆转录转座蛋白基因表现相似的表达模式，在成熟果实中表达水平最高（图4c）。 ? 图3 Harukei-3甜瓜组织的RNA-seq数据集。a，采样部位；b，果实成熟相关基因的表达模式。 ? 图4 果实成熟关键调控因子MELO3C001864启动子区域的逆转录转座子鉴定。a，含果实成熟相关基因的共表达基因簇；b，MELO3C019694周围的编码基因；c，MELO3C019694和邻近