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关于研究蛋白质细胞定位的几种方法 导言 真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。转译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。目前，这方面的工作己取得很人进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白的定位过程也不同。 研究蛋白亚细胞定位主要的几种方法 免疫荧光技术 免疫胶体金标记 与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察 免疫荧光技术 根据抗原与抗体反应得原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原或抗体复合物上含有各种颜色的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激光的照射而发出各种颜色的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 S. pagny等(2003)将XYIT36: GFP转入拟南芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发现GFP的绿色荧光与使用Lewis抗体所做的免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不同部位。说明XYIT36: GFP定位在高尔基体。 免疫胶体金标记 金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。 免疫胶体金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白的定位研究，金标法是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜水平的免疫金染色是目前较理想的免疫定位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和具有双重标记功能等优点。例如用连有15nm金颗粒的GFP单克隆抗体以及连有lOnm金颗粒的过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金标，证明CAT1-GFP定位在过氧物酶体(Akane Kamigaki eta1.,2003)。 GFP及其在生命科学研究中的应用 简介GFP 海洋生物发光是个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光(Morise, H.，Shimomura,1974)。 GFP在水母体内的发光机制如下： GFP荧光的产生主要归功于分子内第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白折叠环化后，在O2存在下分子内第67位甘氨酸的酰基对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团，该过程可自动催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994) GFP晶体结构(如图)显示： 蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm,宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段覆盖，生色团位于大空腔内(CubittAB, 1999)。 GFP在生命科学研究中的应用 GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改善GFP荧光特性，对GFP进行了突变和重组实验。Pang等获得的GFP突变型比野生型亮度增强20倍;Tian等发现野生型GFP是低水平表达，而改良后的GFP表达量增加100倍。Cormack等获得的三位点替代突变体的荧光强度比野生型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿色荧光，使得gfp作为报告基因