生物分析化学-4-凝胶电泳.pptVIP

2021/3/14 * Western 分析检测 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体（硝酸纤维素膜）,然后用这种多肽的特异抗体来检测。 * * * * * * * * 计算单位建议：cm, V, sec * * 极限淌度；有效淌度；表观淌度。 * * 淌度不是一成不变的。 * * 单纯且完美。 * * Tiselius 30－40年代用电泳法（界面移动）成功分离人血清，得到血清蛋白和alpha, beta, gama－球蛋白，为此于1948年获得Nobel化学奖；此后电泳在生化中广泛应用 1950s，提出在各种抗对流介质中进行电泳，克服对流的影响；但发热问题仍是很大的限制因素；1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离效率极大提高 * * Logic of development: free-gel-free-gel. * * A－Ogston模型；B－爬行模型。 * * Cross-linked Acrylamide， N,N-2 methene acrylamide * * * * T%, C% and the size of net, CGE. 5% C is special. * * 与薄层色谱迁移率的定义相同。参考染料目视可见颜色；目标组分则需借助荧光染料在紫外激发下可视。 * * 芯片PCR的例子。 * * * * * * Agilent Off-Gel IEF， ~24 h, 50 ug to 5 mg loading capacity * * * * 2DE：蛋白质组分析；肝蛋白表达2DE谱 数字不断增加。pI反问4.5-9，MW 8-100kD。 * * *若用蛋白质免疫印迹法检测蛋白则称-Western印渍分析 * * 在一定程度上克服胶间重现性的问题。希望标记的结果对蛋白的变化不大。理想的方法？ * * Southern: DNA-RNA * * 电泳分离和选择性检测结合的方法。 * * 保持蛋白的活性很关键 2021/3/14 * 蛋白质样品在 100?C 时用 SDS 和 DTT 处理 3-5 min 后解聚成亚基并形成胶束（短轴约为18?） 2021/3/14 * 凝胶浓度与分子量测定的关系 凝胶浓度T%(C=2.6%) 分子量范围 (kDa) 凝胶浓度T%(C=5%) 分子量范围 (kDa) 5 25-200 5 60-170 10 10-70 10 20-100 15 50 15 10-50 20 40 20 5-40 2021/3/14 * 连续电泳和不连续电泳 连续电泳:相同孔径的凝胶和相同缓冲体系的样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液及pH值恒定。 不连续电泳:不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳。样品在分离胶和浓缩胶的界面上先浓缩成一窄带。由于不同孔径凝胶的分子筛作用,使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。 2021/3/14 * 2021/3/14 * 等电聚焦分离Isoelectrofocusing,IEF） 等电聚焦技术是60年代发展起来的一种蛋白质分离分析手段 根据蛋白质或其它两性分子等电点不同,在一个稳定的、连续变化的pH梯度中进行蛋白质的分离。 不同蛋白质具有不同等电点,根据各自不同的等电点,蛋白质最终被聚焦在一个很窄的区域,成为一个窄而稳定的带,从而起到浓缩和分离作用。 2021/3/14 * 等电聚焦的分辨率 等电聚焦分离的程度取决于pH梯度和电场强度。用测定两个邻近带的pI差即?(pI)来表示分辨率。 D为蛋白质的扩散系数,E为场强,dpH/dx为pH梯度,d?/dpH为蛋白质的迁移率的斜率。只有通过提高场强和使用窄pH范围来提高分辨率。 2021/3/14 * 固相pH梯度等电聚焦Immoblized pH gradients（IPG） IEF 固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合,从而形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度。 此法与传统两性电解质等电聚焦相比,具有分辨率更高、上样量更大等优点。分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法。 可用于蛋白质和多肽的分析、制备。 2021/3/14 * 固相pH梯度丙烯酰胺凝胶基质中的缓冲基团 2021/3/14 * pH 梯度范围的选择 使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上看到样品中绝大多数的蛋白质。 可选用非线性梯度的胶条,这种胶条将两端的pH梯度压得很窄,却可以使中间区域的蛋白质得到较好的分离。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用,也同样可以得到